А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Окра:цивание препарата дает хорошие результаты, но в большинстве случаев оно осуществляется после фиксации микроорганизмов, что не всегда желательно. Основная ценность метода фазового контраста состоит в том, что он дает возчожность наблюдать живые обьекты, не прибегая к их фиксации и окрашива:шю. Применение фазово-контрастного устройства не позволяет увеличить раз:ешаюшую способность микроскопа, но дает возможность увидеть прозрачные 63 объекты более четко и даже выявить некоторые структуры и включения в клетках крупных бактерий. Оптическая система, используемая для получения фазового контраста, состоит из фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы.
Фазовая пластинка расположена в задней фокальной плоскости объектива и предсгвляет собой прозрачный диск, на котором напылено кольцо из металлов. Кольцевая диафрагма расположена под конденсором и представляет собой прозрачную щель в виде кольца на непроницаемой для света пластинке. Световая волна, проходя через клетки микрооргагпгзмов, отстает по фазе примерно на /4 х от- 1 носительно прямых волн, прошедших только через окружающую среду.
В объективе микроскопа эти две волны интерферируют. Результирующая волна имеет ту же длину и аьптлитуду, что и прямая, но несколько отличается от нее по фазе. Этого отличия оказывается недостаточно, чтобы частицу можно было замеРис. 5.5. Схема хола лУчей пРи ис- тить в обычньш микроскоп. Для превращения пользовании Фазе'ю-ко"траспюго разности фаз в разность амплитуд служит фазовая пластина, которая дополнительно сдвигает дифрагированный луч на /4 Х (рис. 5.5). аенсорд 3 — объект; 4 — объектив; 5— Фазоааа пластинка Фазовый згйгйекпг создается в результате ин- терференции прямых лучей, не отклонившихся при прохождении через прецарат„и боковых лифрагировапных лучей, которые в результате прохождения через объект и через Фазовую пластинку либо совпадают по фазе с прямыми, либо сдвинуты относительно них на '/, Х, т.е.
находятся в противоФазе. В первом случае обе волны складываются и изображение объекта становится более светлым, чем окружающий фон. Это светлый негативный контраст. Ио принципу негативного контраста устроен так называемый ангпапралъпый микроскоп. Во втором случае дифракционная волна вычитается из прямой и объект выглядит более темным— темный, позитивный, контраст (рис. 5.6).
Кроме того, кольцевая диафрагма уменьшает интенсивность центрального светового пучка, что также усиливает контрастность. Широкое примененгле нашли фазово-контрастные устройства, выполненные по схеме позитивного контраста. Наиболее распространена модель КФ-4 (рис. 5.7). Фазово-контрастное устройство предсташьяет собой приставку к микроскопу, состоящую из вспомогательного окуляра, специальных фазовых объективов и кондепсора с набором кольцевых диафраглб каждая из которых соответствует фазовой пластинке определенного объектива.
Кольцевые диафрагмы устаноигены в револьверном диске под кондепсором и поворотом диска могут легко меняться, причем в окне крышки диска появляется цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива. Кроме того, в револьверном диске имеется свободное отверстие — «пулевая диафрагм໠— для наблюдений обыч- вол Рис. 5.6. Схемы, поясняющие принцип фазового контраста: а — сдвиг фаз между дифрвгироввнной 1Р) и прямой 15) волнами; б — темный контраст; «в светлый контраст „гзг о гм бн- Рис.
5.7. Фазово-контрастное устройство КФ-4: 1 — конденсор; 2 — револьверный диск с набором кольцевых диафрагм; 3 — центровочные вин- ты; 4 — вспомогательный микроскоп; 5 — набор фазовых обьективов ным способом. Конденсор снабжен двумя винтами для центровки кольцевой диафрагмы относительно фазового кольца объектива. Все фазовые объективы имеют на оправе обозначение «ф», Ими можно пользоваться и при обычной микроскопии, но из-за наличия фазового кольца они дают изображение пониженного качества. Прядок работы с фазово-контрастным устройством.
Методика исследования живых микроорганизмов с фазово-контрастным устройством сводится к следующему. 1. Удаляют из микроскопа обычный конденсор н на его месте устанавливают фазовоконтрастный. Диск револьвера коцденсора поворачивают таким образом, побы в окошке стояла инфра «Ом Ирисовая диафрагма конденсора должна быть полностью открыта. 2. Заменяют объектив 40х па фазовый объектив 40 х ф.
3. На црелметный столик помещают препарат «раздавленная капля». Устанавливают свет по Келеру, пользуясь обьективом 8х. 4. Устанавливают объектив 40 х ф. 5. Окуляр заменяют на «вспомогательный» и, перемещая тубус последнего, добиваются четкой фокусировки фазовой пластинки объектива. Она имеет вид темного кольца. б. Поворотом диска револьвера выбирают объектив 40хф — с кольцевой диафрагмой.
Теперь под микроскопом видно нс только фазовое кольцо, но и светлое колыю— щель диафрагмы. 7. Пользуясь винтами для центровки конденсора, перемещают кольцевую диафрагму так, чтобы она совместилась с фазовым кольцом (см. рис. 5.6). Если ширина темного кольца (фазовой пластинки) больше, чем ширина светлого кольца (щель диафрагмы), то необходимо, чтобы свеглое кольцо вписалось в контур темного кольца концентрично. 3. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и фокусируют препарат, 9. При микроскопировании с другими объективами устанавлвваюз.
соответствующие кольцевые диафрагмы и каждый раз проверяют центрировку, пользуясь вспомогательным окуляром. 5.1.4. Люминесцентная микроскопия Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы вешеств, способных к люминесценции, поглошают энергию падающего света и переходят в возбужденное состояпгге, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот переход сопровождается отдачей избытка энергии в виде света — люминесценцией.
Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300 — 400 нм или сине-Фиолетовыми лучами с длиной волны 400 — 460 нм. Ряд веществ биолопдческого происхождения — хлорофилл, витамин Вм алкалоиды, каротиноиды, порфирины, кофакторы, некоторые антибиотоки и другие соединения обладают собствегпгой люминесцегщией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке группе микроорганизмов, например зеленым водорослям, некоторым дрожжам и бактериям (метаногенам), свойственна первичная люминесценция. Однако клетки большинства микроорганизмов люминесцируют очень слабо, поэтому их обрабатывают специальными красителями — флуорохромами, обладающими люминесценцией. Люминесценцию объекта после обработки флуорохромамн называют наведенной, или вторичной.
Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры и даже отметить их изменения при различных функциональных состояниях клетки. Этот вид микроскопии широко применяют для выявления и учета живых и мертвых клеток про- и эукариот в природных субстратах, почвах, илах, ризосфере растений, а также для цитологических исследований клеток. Люминесценцию в сине-фиолетовых лучах видимого света можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр, проникаюшие сине-фиолетовые лучи видимого спектра.
Синие лучи, мешающие выявлению люминесценции„убирают желтым светофильтром, который помещают на окуляр микроскопа. В результате наблюдатель видит на темном фоне люминесцируюшие объекты. Однако для микробиологических исследований наиболее удобен люминесцентный микроскоп, в котором люминесценция возбуждается сине-Фиолетовыми 66 лучами и ближним ультрафиолетом. Оптическая схема люминесцентных микроскопов позволяет наблюдать объекты при освещении их как в проходящем, так и в падающем свете.
В современных люминесцентных микроскопах возбуждающий люминесценцию свет направляется на препарат сверху, через объектив (МИКМЕД 2, ЛЮМАМ РПО 11 — ОМО, Санкт-Петербург, Россия; «Ах(озсор» — Уе)зз, )епа, Оепвапу). При освещении объектов сверху (для возбуждения люминесценции) одновременно допускается освещение объектов снизу с помощью кондепсора темного поля или фазово-контрастного устройства.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
