А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. От увеличения объектива зависят еше две его характеристики — рабочее расстояние, т.е. расстояние от фронтальной линзы до плоскости препарата при сфокусированном объекте, и площадь ноля зрения. Чем больше увеличение объектива, тем меньше его рабочее расстояние и поле зрения. Микроскопы имеют «сухие» объективы для наблюдения живых микроорганизмов, а также для поиска нужного поля зрения, лающие увеличение в 8 (10) и 40 раз, и иммерсионные, увеличивающие объект в 90 (! 00) раз и позволяющие провести более детальное изучение формы и ст1юения микроорганизмов.
Окуляр содержит две линзы — глазную (верхнюю) и собирательную и служит для рассмглрения изображения предмета, даваемого обьективом, т.е. выполняет роль лупы. Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе, например 15 к. Общее увеличение окуляра повышается с уменьшением фокусного расстояния составляющих его линз, поэтому более сильные окуляры будут короткими, а более слабые — длинными. Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, например, использование окуляра 15 х и объектива 90х позволяет увеличить объект в 1350 раз. Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа.
Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешаюшей способностью микроскопа, которая зависит от длины волны используемого света и числовой апертуры оптической системы микроскопа. Разрешаюшдя способность связана обратной зависимостью с пределом разрешения — минимальным расстоянием между двумя точками, при котором еШе можно разли ппь каждую из них.
Предел разрешения определяется по формуле Х гГ= А+А,' где г( — минимальное расстояние между двумя точками; А, — числовая апертура обьектива; А, — числовая апертура конденсора; Х вЂ” длина волны используемого света. Числовая апертура определяется произведением синуса половины отвесного угла на показатель преломления среды, граничашсй с линзой: А = в сйп и.
Иными словами, числовая апертура — это оптический охват линзы; она является мерой количества света, попадаюшего в линзу. Использование объективов с большей апертурой и коротковолново~о света позволяет увидеть структурную организацию клетки и даже крупные вирусы. Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом, не может быть больше 1, так как показатель. преломления воздуха равен 1, а угол и не может быть больше 90' (т.е. яп и < 1).
В микроскопе МБР-1 объектив 40х имеет апертуру 0„65, а конденсор— примерно 1. Такил~ образом, прн использовании объектива 40х и зеленого света с длиной волны 550 нм (0,55 мкм) предел разрешения составляет 0,33 мкм. Повысить разрешаюшую способность можно двумя путями: либо освещать объект более короткими лучами света„например ультрафиолетом, что требует применения дорогостоян1ей кварцевой оптики и соответствуклцих источников света, дорогостоящих ртутных ламп, либо увеличивать показатель преломления среды, граничащей с линзой, с тем чтобы приблизить его к гюказателю преломления стекла, на котором находится объект (и стекла = 1,5).
Дяя этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления, большим показателя преломления воздуха, например каплю воды (я = 1,3), глицерина (я = 1,4) или иммерсионного (например кедрового) масла (я = 1,5). Для каждой указанной жидкости выпускают специальные обьективы, которые называются иммерсионными. Числовая апертура этих объективов возрастает благоларя увеличению как значения и, так з!и ш Числовая апертура объектива указана на его оправе. Обьективы микроскопа МБР = 18к и 40» имеют апертуру ссютветственно 0,20 и 0,65. У масляного иммерсионного объектива с увеличением 90к апертура 1,25.
На оправе этого объектива нанесено также обозначение «МИ» — масляная иммерсия — и черное кольцо. На оправе объектива водной иммерсии имеется обозначение «ВИ» (водная иммерсия) и белое кольцо. Этот объектив увеличивает в 70 раз (70к) и имеет апертуру 1,23. Апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Когла она меньше апертуры объектива, оптические возможности линзы последнего не будут использованы полностью из-за слабости попадающего в нее светового потока. Если апертура конленсора больше апертуры обьектива (что, в частности, бывает при работе с сухими системами), то необходимо несколько прикрыть ирисовую диаФрагму конденсора.
Это приведет к устранению рассеянного света и даст нужную контрастность изображения. Неиммергированный конденсор микроскопа МБР-! имеет апертуру не более 0,95. Помещая иммерсионное масло между верхней линзой копленсора и нижней поверхностью предметного стекла, повьпцают апертуру ко~иенсора до 1,2. В работе со световым микроскопом следует помнить, что четкое изображение получается при хорошем освещении, однако диафрагмирование конденсора дает эффект контрастирования живых объектов. Препарат должен быть частью одноролпой оптической системы, что достигается заливкой объекта водой, маслом или лругой подходяшей жидкостью. В случае необходимости наблюдения объекта через дно чашки Петри лучше использовать вогнутое зеркало, устраняя эффекты искажения, вызванные неровностью поверхности чашки.
Порядок работы со светлопольным микроскопом прп внешнем источнике освещения. Хорошие результаты при работе с микроскопом могут быть получены только при условии правильного освещения объекта. Лучший способ освещения основан на системе Келера; ее последовательные этапы описаны ниже. Установка света по Келеру*. 1. Устанавливают микроскоп и осветитель на крестовину, что обеспечивает необходимое расстояние между источником света и зеркалом микроскопа.
На предметный столик помещают препарат. Устанавливают объектив 8 к. Полни- мают конденсор вверх до упора. Открывают полностью диафрагму конденсора. Отодвигают матовое стекло. Ставят плоское зеркало. Закрывают диафрагму осветителя, оставив только небольшое отверстие. 2. Включают осветитель.
Пользуясь рсостатом, регулируют яркость света та-им образом, чтобы нить лампы давала слабый накал (иначе можно повредить глаза!). Корпусу осветителя придают такое положение, прн котором свет падал бы в центр зеркала. " Приводимая методика установки света пужая только при работе с микроскопами старых ' зразцов, не имеющих вмонтированного в микроскоп источника света, яо оснащенных зеркв'чи дяя улавливания и направления света в кояденсор.
При работе с современными микроско',ми эта методика не требуется. 3. Закрывают зеркало микроскопа кружком белой бумаги и фокусируют на него изображение витка нити лампы осветителя. Это достигается передвижением патрона лампы осветителя. 4. Глядя в окуляр и слегка вращая зеркало, ловят в поле зрения изображение краев диафрагмы осветителя, которое будет иметь вид светлого пятна с нечеткими краями. Величина пятна зависит от степени раскрытия диафрагмы и положения объектива. Чем больше отверстие диафрагмы и чем выше объектив, тем болыпе пятно. Если оно занимает значительную часть поля зрения, его уменьшают, несколько опустив объектив или сузив отверстие диафрагмы осветителя, глядя при этом в окуляр.
В тех случаях, когда пятно сдвинуто к краю поля зрения, сто переводят в центр осторожным поворотом зеркала. По ряду причин !отсутствие идеального точечного источника света, аберрация) под микроскопом чаще всего видно не одно пятно, а несколько четких пятен. Установку света осуществляют по центральному пятну. В случае образования по краям диафрагмы осветителя цветной бахромы центрируют конденсор, смещая его регулировочными ручками в сторону красного цвета бахромы и корректируя при этом центровку зеркалом до момента симметричного распределения цвета бахромы. 5.
Используя объектив 8к, фокусируют объект в области светлого пятна. б. Слегка опуская конденсор, фокусируют в ~поскости препарата изображение краев диафрагмы осветителя, т.е. получают изображение светлого пятна с четко очерченными краями. 7. С помощью зеркала переводят полученное яркое пятно в центр поля зрения. Если все сделано правильно, то это светлое пятно, видимое одновременно с препаратом, будет равномерно освещено.
В противном случае нужно добиться его равномерного освещения, слегка поворачивая корпус осветителя. 8. Открывают диафрагму осветителя так, чтобы светлое пятно заняло все поле зрения. 9. Устанавливают объектив 40 к для препарата «раздавленная капля» или 90 к (!00к) для фиксированного окрашенного препарата, на который предварительно наносят иммерсионнос масло, и фокусируют объект. Яркость освещения следует регулировать только изменением накала лампы осветителя или применением светофильтров. Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не изменять! Никогда не следует поднимать и опускать конденсор или необоснованно использовать его ирисовую диафрагму для регулировки яркости поля зрения, так как зто снижает разрешающую способность микроскопа, ухудшает изображение, может даже исказить его.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
