А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Поверхность среды в пробирках заливают парафином. Трубки Бурри — это стеклянные трубки длиной 20 — 25 см, диаметром 1,0 — 1,5 см. Трубки стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также резиновой пробкой (рис. 3.2). При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов засеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки и, после того как среда застынет, платно прижимают к ее поверхности дно чашки.
Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином (рис. 3.3). Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатох — вакуумных металлических камерах„снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из Рис.
3.2. Трубка Бурри: 1 — трубка, подготовленная к стерилизации; г — колонии анаэробных микроорганизмов в толще агаризованной среды Рис. 3.3. Культивирование анаэробов в чашке Петри: ! — агаризованная среда; 2 — парафин 41 азота (90 — 80%) и углекислоты (10 — 20%), до давления порядка 67. 1Оз Па (0,7 ати). Избыточное давление исключает возможность диффузии кислорода воздуха. Некоторые строгие анаэробы, например ацетогенные бактерии, метаногены, некоторые грибы, расщепляющие целлюлозу, микроорганизмы рубца жвачных животных, погибают даже при кратковременном контакте с кислородом воздуха. При культивировании таких микроорганизмов следует применить методы, позволяющие исключить молекулярный кислород из сред культивирования, создавать и поддерживать в них низкий окислительно-восстановительный потенциал (Е)>).
Степень поглощения кислорола и восстановленности среды определяется Е)>, который может быть измерен электрометрически на потенциометре или с помощью индикаторных красителей, например резазурина, феносафранина, нейтрального красного и т.д., изменяющих окраску при изменении Е7>. Особенно удобен резазурин, который добавляют к средам в концентрации 1 мг/л и стерилизуют вместе с минеральными компонентами средьк В окисленной форме он окрашен в голубой цвет, при восстановлении цвет меняется на слабо-розовый, полностью восстановленная форма бесцветна. Резазурин изменяет окраску при значениях ЕЬ, близких к 420 мВ, феносафранин — в области 252 мВ. Принципы культивирования строгих анаэробвв, разработанные профессором Р.
Хангейтом (США), состоят а следующем: 1) все процедуры — приготовление и разлив сред, посевы, культивирование микроорганизмов и т.д., проводят с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа, использование герл>етически закрытых сосудов и т.д.); 2) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрии, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кислорода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки; 3) все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, продутых газоьц не содержащим кислород; 4) все трубки и шланги, используемые для пропускания газа, должны быть изготовлены из материала, не допускающего (медь) или допускающего в слабой степени диффузию сквозь него кислорола воздуха (бутилированная резина).
В качестве поглотители кислорода из газов в лабораторной практике используют щслочные растворы пирогаллола или дитионита натрия, металлическое железо, медь, нагретую до 400 С, или некоторые другие реактивы. При этом необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и обьем замкнутого пространства, в которол> выращивают микроорганизм. Например, на каждые 100 мл емкости используют ! г пирогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия. Поскольку многие анаэробы нуждаются в углекислоте, пирогаллол часто растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната натрия. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором, содержащим окислительно-восстановительный и>шикатор. Для приготовления раствора смешивают равные объемы 0,024%-го )чаОН, 0,015%-го водного метиленового синего и 6%-й глк>козы; а качестве антисептика к раствору добавляют тимол.
Перед использованием в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают на кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в анаэростат или анаэробный бокс. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным. Ддя удаления следов кислорола из промышленных газов, которые поставляют в баллонах, содержащих до 1,5% воздуха, используют следующую процедуру: газ пропускают через стеклянную трубку, заполненную медными стружками и нагретую до 400 "С с помошьк> электронагревателя (лля этой цели подойдет спираль от бьповой электроплитки с керамическими изоляторами).
Обработанный таким образом газ прак- 42 тически не содержит кислорода, так как медь при высокой температуре эффективно связывает кислород с образованием СцО. Для регенерации меди используют газообразный водород: СцО + Нз = Сц+ Н,О. !'акой газ необходим при заполнении переходного шлюза в анаэробном боксе. В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и тиогликолат натрия. Обычно готовят 1%-е растворы этих восстановителей в 5%-м растворе бикарбоната натрия, стерилизук>т автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия из расчета 250 — 500 гиг/л, а тиогликолат — до 250 мг/л среды. Восстановители используют в концентрациях, не влияющих на рост микроорганизмов. Работа со строгими анаэробами представляет большие трудности и требует специального оборудования (сьь гл. 16).
Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируют. У мсзофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37 С. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80 — 90 С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5 — 10 'С. Отклонение температуры от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов, поэтому микроорганизмы выршцивают в термостатах или специальных тсрмостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура. Мезофильные бактерии, естественным местом обитания которых являются вода и почва, выращивают в интервале от 20 до 30'С, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или кишечника человека и животных культивируют при более высокой температуре: 35 — 37 'С.
Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры. Свет. Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие, поэтому такие микроорганизмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естественное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фототрофов выращивают в люминостатах, т.е.
камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необходимая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству. Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и ллинами волн, при которых культивируемые микроорганизмы осуществляют фотосинтез.
Для выращивания пурпурных и зеленых бактерий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования цианобактерий и микроводорослей нужно применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спектрального состава света обращают внимание на освещенность, которую измеряют с помощью люксметра. Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в доступной для клетки форме, т.е. жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворенных веществ и не может быть использована микроорганизмами. Доступность воды в субстрате для роста микроорганизмов выражают величиной активности воды (а„.): а„, = Р/Р„где Р— давление пара над раствором, мм рт.
ст.; Р, — давление пара над чистой водой 43 при данной температуре, мм рт. ст. Для дистиллированной воды а„, = 1,00. При растворении различных веществ в воде эта величина уменьшается и соответственно падает доступность для клетки водьь Микроорганизмы могут расти на средах, где а„= 0,99 — 0,61. Потребности в доступной воде у бактерий, как правило, выше, чем у дрожжей и мицелиальных грибов.
Так, большинство бактерий, за исключением галофилов, хороню растет на средах с величиной а = 0,99 — 0,95; минимальная величина а, обеспечивающая рост дрожжей, находится в пределах от 0,91 до 0,61. Активность воды в среде можно определизь по формуле а„= .4/100, где А— относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равновесии в закрытом сосуде, содержащем среду.
Различную активность вольт в питательной среде или субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как ХаС!, КС1, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль. 3.3. РЕЖИМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Существует два принципиально разных режима выращивания микроорганизмов в жидкой среде. В одном случае после инокуляции среды в нее не добавляют и из нее не удаляют какие-либо компоненты, кроме газовой фазы. Такой режим культивирования, называемый периодическим, может поддерживать размножение клеток только в течение ограниченного времени, на протяжении которого меняются сосзав исходной среды и окружающие условия.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
