А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 10
Текст из файла (страница 10)
При аэрации среды учитывают два показателя: интенсивность и степень аэраиии. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кислорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Степень аэрации — это объем воздуха, продуваемый через определенный обьем среды за единицу времени. Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выраи1ивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок с 100 — 200 об/мин и более.
Чем больше частота вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе 38 на одной и той же качалке можно за счет уменьшения объема среды или применения колб с отбойниками — вдав>пгваниями стекла внутрь в виде 4 — 8 отростков длиной 2 — 3 см (см. рис. 2.2).
При вращении колб с отбойниками поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников, тем сильнее разбрызгивание жидкости, тем выше аэрация. Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов на качалке косвенно характеризуют суль4>итным числоль В основе метода лежит определение скорости окисления сульфита в сульфат в присутствии меди как катализатора. Сульфит, остави>яйся неокисленным, связывают йодом. Количество йода, не вступившего в реакцию с сульфитом, оттитровывают тиосульфатом.
Таким образом выясняют, сколько сульфита в определенном объеме его раствора за определенное время окисляется кислородом воздуха. Метод дает лишь сравнительные данные о скорости поглощения кислорода раствором сульфита в условиях аэрации, аналогичных опытным. Определение сульфитяого числа.
Готовят следующие реактивы: 0,1 н. раствор тиосульфата (Ха>8,0>) с установленным тип ром; !%-й раствор крахмала; О,! н. свежеприготовленный раствор йода; 0,8 н. свежеприготовленный раствор сульфита )ча>80> с Сц804 Количество сульфата меди в растворе сульфита натрия соответствует 0,001 М. Сернокислую медь растворяют отдельно в небольшом объеме воды, а затем по расчету вносят в раствор сульфита.
Следует выяснить, какое количество йода полностью связывает количество взятого для работы сульфита. Для этого к 5 мл свежеприготовленного раствора сульфита в конической колбе на 250 мл прш>ивают из бюретки раствор йола до появления светлокоричнсвой окраски. Так опрелеляют объем раствора йода а. Затем добавляют 0,5 мл 1%-го раствора крахмала и титруют 0,1 н. раствором тиосульфата до исчезновения синей окраски. На титрование должно пойти 1 — 3 мл тиосульфата. Далее проверяют правильность определения объема йода и титруют его тиосульфатом, так же, как в предыдущем случае.
Если обьем йода подобран правильно, то на его титрование идет около 30 — 40 мл тиосульфата. Для опрелеления сульфитного числа используют конические колбы обьемом 750 мл без отбойников и с отбойниками. Сульфит в колбы наливают в количестве 300 мл, !00 мл (колбы без отбойников) и 100 мл (колба с отбойниками). Затем из каждой колбы отбирают по 5 мл сульфита в конические колбы на 250 мл, в которые заранее наливают по а мл раствора йода. Колбы закрывают часовыми стеклами и оставляют в темноте на 5 — 10 мин, затем споласкивают часовые стекла дистиллированной водой в туже колбу, которую они закрывали, и титруют ее содержимое О, ! н.
тиосульфатом. Количество миллилитров тиосульфата, пошедшего на титрование, П„, запись>вак>т в таблицу. Колбы с разными объемами сульфита помещают на определенное время на качалку. Время включения и выключения качалки замеча>от с точностью до ! мин. К моменту осгановки качалки через 15 — 20 мин в три колбы на 100 мл наливают подобранный для работы раствор йода а. Остановив качалку, отбиршот из встряхиваемых колб по 5 мл раствора сульфита и сразу же приливают пробы к раствору йода.
Снова включают качалку еще на 20 — 25 мин. Отобранные пробы вылерживают в темноте и снова титруют 0,1 н. раствором тиосульфата, как указано выше. Количество миллилитров тиосульфата П„, записывают в таблицу. В ту же таблицу вносят результаты П,, полученные титрованием пробы сульфита, отобранной через последующие 20 — 25 мин. Рекомендуемая продолжительность встряхивания колб с сульфитом подобрана специально для условий настоящего опыта. В других случаях она может быть иной.
39 Сульфит при аэрации окисляется в сульфат, поэтому на его связывание требуется все меньше йода и соответственно все больше тиосульфата идет на титрование свободного йода. Данные титрования, близкие к данным титрования йода без сульфита, для расчетов не используют, так как они свидетельствуют о полном окислении последнего к моменту отбора проб, и результаты определения будут ошибочными. Сульфитное число рассчитывюот следующим образом: скорость поступления кислорода в раствор сульфита (мг Оз/л/мин) = ((П, — П У Т) . (0,8и), где τ— количество 0,1 н.
раствора тиосульфата (мл), пошедшее на титрование 5 мл распюра сульфата до аэрации; П, — количество 0,1 н. раствора тиосульфата (лш), пошедшее на титрование 5 мл раствора сульфита после аэрации; Т вЂ” время аэрации в минутах; 0,8 — количество кислорода (мг), идущее на окисление ! мл 0,1 н. раствора тиосульфата; а — коэффициент пересчета на 1 л сульфитв (в данном случае ои равен 200, так как иа титрование берут 5 мл сульфита). Для каждой колбы рассчитывают сульфитные числа после первого и второго периодов аэрации и берут среднее из двух чисел или более лостоверное число.
Для аэрации культуры микроорганизмов помимо перемешивания можно применять продувание стерильного воздуха через толщу среды. Этот способ часто используют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы и различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов — антибиотиков, ферментов, кислот. Скорость потока воздуха через среду необходимо контролировать. Для этого используют различные приборы — газовые часы, ратометры и др.
В фермен- 1 терах количество пропускаемого воздуха поддер- Я живают на заданном уровне автоматически. Воз- дух стерилизуют путем прохождения через акти- И м М вированный древесный, уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком, или специальные ткани из полимеров. В лабораторных опытах, когда 4 объем и скорость поступления воздуха невелики, используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для возможно более сильного распыления воздух пропускают через мелкопористые пластинки — барботеры; в лабораторных опытах с этой целью применяют стеклянные 5 фильтры.
Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, используют обычный воздух. Продувание сред кислородом в лабораторных 3 условиях нс рекомендуется, так как чрезмерное насьпцение среды кислородом (до 40 мг/л) мо- - Ф- жет привести к угнетению роста микроорганизмов. В фермснтерах принудительную аэрацию обычно совмещают с механическим псремешиРис. 3.1.Схемаферментерадля ванисм среды мешалками, скорость вращения глубинного культивирования которых может достигать сотен и даже тысяч обоаэробных микроорганизмов: ротов в минуту. Схема фсрментера для глубинно— вход воздгха; 2 — выход воз- го кульпшировашш аэробньгх микроорганизмов хя.
5 вешах„з пРИВЕдена на РИС. 3.1. 40 ° Культивирование нниэробных микроорганизмов более сложно, чем культивирование аэробав, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют разные приемы, нередко комбинируя их друг с другом.
Выращивание в высоком слое среды — наиболее простой способ ограничения воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Поскольку нельзя стерилизовать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и стерильно доливают ею сосуд для культивирования сразу после посева. Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане 30 — 40 мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород возцуха, и вносят на дно посевной материал.
Иногда используют метод культивирования в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости, поэтому в вязких средах, таких, как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облитатные анаэробы, например возбудители маслянокислого или апетонобутилового брожения. Вязкость сред легко увеличить добавлением к пим 0,2 — 0,3 % агара.
Для получения изолированных колоний при вьщелении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толгце пингательной среды. Для этого посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48 — 50 С агаризованную, желательно осветленную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или переливают стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки Бурри или чашки Петри.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
