А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Каррагинан не используется болыпинством видов микроорганизмов. Для получения устойчивого при 45 и б0'С геля использукп соответственно 2,0 и 2,4% каррагинана. 35 Та бл и ца 3.1 Основные характеристики веществ, употребляемых для уплотнения питательных сред Характеристика Кремнекислый гель Агар Желатин Исходный материал лля получения Кожа, кости, хрящи Морские водоросли Кремнекислый калий или натрий и соляная кислота Основные компоненты Нолисахариды Белки Кремневая кислота Темгюратура плавления, С 22 — 25 Температура застывания, С 22 — 25 Действие протеаз Не действуют Действуют Не действуют Конденсационная вода Не выделяется Выделяется Не выделяется 1,0 — 3,0 Употребляелгая концентрация, % 10 — 20 3.2.
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы. Зб Для некоторых специальных исследований, наприл1ер для получения хорошо видимых в толще средь1 изолированных колоний анаэробных микроорганизмов, применяют осввтлвяные среды. Прозрачные среды получают несколькими способами.
Наиболее простой способ осветления — фильтрование среды через ватный фильтр. Если этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков куриного яйца. Для осветления 500 мл среды достаточно одного яй1ьз. Белок отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования сплошной пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и остуженную до 45 — 50 С среду.
Перед внесением белка проверяют рН и, если необходимо, доводят его до 7,0 — 2,3. Среду с белком тщательно перемешивают и прогревают при 100 С в автоклаве в течение часа. Белок свертывается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Когда свернувшийся белок поднимается на поверхность или опускается вниз, среду быстро отфильтровывают в горячем виде через вату. При этом удобно пользоваться специально подогреваемыми подставками для воронок, благодаря которым предотвращается застывание среды во время фильтрования.
Синтетические агаризованные среды, в которые вносить белок нежелательно, осветляют следующим образом. Среду наливают в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 1Π— 12 ч, обычно на ночь. При таком медленном остывании все взвешенные частицы оседают па дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана, верхнюю (прозрачную часть) срезают, помешают в колбу и вновь стерилизуют.
Активная кислотность среды. Активная кислотность (рН) среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинспю бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0, микроскопические грибы, напротив, предпочитают слабокислые среды, поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Измергпот рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораторной практике удобно использовать различные жидкие или бумажные индикаторы (см. приложение 5). Широко применяется„например, жидкий двуцветный индикатор, бромтнмоловый синий (бромтимолблау).
Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге рН от 6,0 до 7,6. При рН 7„3 индикатор имеет сине-зеленую окраску. В случае необходимости рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (НС1„Н~ЗО,), щелочей (МаОН, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Ха~СО„МаНСО~). Для корректировки рН целесообразно иметь стерильные растворы разной концентрации.
Значение рН сред может измениться в процессе стерилизапии„поэтому после стерилизации его следует проверить и, если требуется, довести до нужного с помощью стерильных растворов кислоты или щелочи. Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе их культивирования. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Например, при потреблении углеводов в среде накапливаются органические кислоты, снижающие рН среды. В средах с КМОь как уже отмечалось, рН возрастает за счет более интенсивного потребления нитрат-иона и накопления ионов калия. Чтобы не допустить чрезмерного изменения рН в культурах микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы.
Иногда в среды добавляют буФерные растворы (см. приложение 6). В микробиологической практике чаще других применяют 4ос4атные буферы. Однако если рост микроорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению рН ограничено. В связи с этим для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение буферов нс эффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Для нейтрализации кислот по ходу развития культуры можно применять 10%-й стерильный раствор ХаНСОл Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые в пропессе жизнедеятельности образуют кислоты, но не обладают устойчивостью к ним.
К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также многие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нужно поддержать рН в слабощелочных средах, так как для диапазона рН от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. С этой целью иногда приходится периодически или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контроле значения рН. В современных ферментерах это достигается с помощью специальных автоматических устройств. 37 Аэрация Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки в больших количествах.
Значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя. Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрогрильных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут, если его парциальное давление меньше, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для многих кислород даже токсичен: оп угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы называются облигатными анаэробами.
Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. Например, некоторые дрожжи и энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осуществляют аэробное либо дыхание, либо брожение. Неодинаковые потребности микрсюрганизмов в свободном кислороде учитывают при выборе способа их выращивания. ° Культивирование аэробных микроорганизмов. Аэробные микроорганизмы можно выращивать на поверхности жидких и плотных сред — поверхносптое культивирование или внутри жидкой питательной среды — глубинное культивирование.
При поверхноспюм культивировании кислород поступает в клетки микроорганизмов непосредственно из воздуха, поэтому важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном — чашки Петри, колбы Виноградского, матрасы (см. рис. 22). Растущие в жидких средах аэробные микроорганизмы часто образуют на поверхности пленку.
Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ес помутнение. Поверхностное культивирование применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности. Все способы глубинного культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
