А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В автоматических автоклавах подачу пара регулируют электроконтактным манол1етром. По окончании врелгени стерилизации выключают нагрев автоклава. Давление в автоклаве постепенно палает и сравнивается с атлюсферным. Лишь после этого откры вают кран, выводящий пар. Презкдевременное открывание крана недопустилю, так как перегретые среды при резком снижении давяепия сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает стерильность материала.
Когда пар выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом осторожность во избежание ожога паром лица и рук. Удаление пара из стерилизацнонной камеры автоклавов, оснащенных вакуумным насосом, осуществляют с помощью насоса. Однонременно происходит подсушивание стерильного материала. Поскольку автоклав работает при высоких давлениях и температурах, неправильное обращение с ним может быть причиной несчастных случаев. Установка автоклава и работа с ним произволятся при точном и строгом выполнении правил, указанных в прилагаемой к автоклаву инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица, имеющие специальное разрешение. Прн необходимости проконтролировать температуру в автоклаве пользуются разными веществами, плавящимися при определенной телгпературе.
Эти вещества предварительно смешивают с нейтральными красителями и пол~ешагот в автоклав до начала стерилизации. В качестве индикаторов температуры используют фенантрен (температура плавления 98 — 100'С), бензаурин (115'С), серу (119 С), бензойную кислоту (121 — 122'С), мочевину (132 С), глюкозу (146'С), тиомочевину (180'С), аскорбиновую кислоту (187 — ! 92 С). На 100 г этих веществ берут 0,0! г красителя (фуксин, метиленовый синий), тщательно смешивают, рассыпают в стеклянные трубочки с одинаковым диалгетром и толщиной стенок, запаивают и в вертикальном положении раскладывают между стерилизуемым материалом в автоклаве.
По достижении в сосуде соответствующей юмпературы эти вещества расплавляются и окрашиваются в цвет добавленного в них красителя. Подготовка сред к стерилизации. При автоклавировании 3 — 5% жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5 % листиллированной волы. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию, Среды обычно стерилизуют в пробирках, а б а колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы пре- Рис. 4.2.
Ватные пРобки: дотвратить смачивание пробок. Сосуды со среа — приготовлена правильно; б, в — дами закрывают вагными пробками. Они пРело храняют среду от заражения микроорганизмами, находящимися в окружающем воздухе. Пробки должны быль достаточно плотными, чтобы выполнять зту функцию„ но с достаточно Равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культур с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом. Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки примерно 4 см.
Пробка должна входизь в пробирку на 1,5 — 2,0 см (рис. 4.2). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой. Перед стерилизацией пробки можно прикрьпь бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном, фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой.
Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки. Выбор режима автоклавироваиия. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре ! 11 — 138 С, т.е. от 0,5 до 2,5 ати. Температура ниже 1 11 'С не может считаться надежной; температура выше 138 С, как правило, не является необходимой, к тому же чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. При использовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считают следующие режимы стерилизации: 15 — 45 мин при 121 'С (! ати) и 10 — 30 мин при 128 'С (1,5 ати). Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 ати.
Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются прежде всего их составом, термоусгойчивостью или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты„содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожжевой автолизат и др.), обычно стерилизуют при 0,5 ати в течение 15 — 30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при ! ати 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому по стерилизация начинается фактически после того, как агар расплавится.
Но и расплавленный агар требует для стерилизации в лва раза больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (тальк, мел) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160'С втечение 2 чили 1ч при 170 С. Слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см. Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причем она, кроме того, нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 ати либо один раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда 2 ч при 2 ати.
Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в ее состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, чем выше температура и продолжительнее время стерилизации, тем интенсивнее происходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если реакция среды щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа; они карамелизуются и сахара становятся непригодными лля использования бактериями.
В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так„если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизапии растворы объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать олним и тем же способом.
Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объела стерилизуемого субстрата. Чем болыле объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма емкостей 1табл. 4.2). Это нужно учитывать в практической работе. Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одновременно в пробирках и больших бутылях. Если среда стерилизуется по режимам„рекомендуемым для малых объемов, содержимое бутыли может не простсрилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчетом на большой объем, среда в пробирке прогревается намного дольше и может испортиться. После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2 — 3 сут в термостате при 30 'С.
Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново. Дробная стерилизация (тнндалнзацня) н настернзацня. Тивдализацяя, или дробная стерилизация, была предложена в 1877 г. Дж. Тиндалем. Она применяется для сред, портяшихся при действии температур выше 100 С. Тиндализацию осуществляют текучим паром в автоклаве с незавинченной крышкой или в кипятильнике Коха. Среды прогревают несколько раз по 10 — 15 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
