А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Диафрагмой конденсора пользуются только для изменения контрастности изображения. Необходимость использования диафрагмы конденсора отпадает, если заранес привести в соответствие апертуру конденсора с апертурой используемого объектива. Как указывалось, апертура неиммергированного конденсора близка к 1, а числовая апертура объектива 40к составляет 0,65. Практически можно воспользоваться следующим приемом: установив свет по Келеру и сфокусировав препарат с объективом 40х, вынуть окуляр и, глядя в тубус, прикрывать диафрагму конденсора до тех пор, пока края диафрагмы не станут ви!щы у границы равномерно освещенной задней линзы объектива.
В этот момент числовая апертура конденсора будет примерно равна числовой апертуре бО объектива. При работе с объективом 90х диафрагму конденсора оставляют открытой, поскольку числовая апертура этого объектива 1,25. Правила работы с иммерсиоииым объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет по Келеру. Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла, заменяя тем самым «сухую» систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения.
После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной бензином или бензолом.
Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Эффективен способ удаления масла как жидкого, так и застывшего, свежеотломленным пенопластом. В отдельных случаях помогает протирка тканью, смочеьпзой дистиллированной водой. Края линз с выступающей оправой очищают с помощью палочки, обернутой тканью. 5Л.2. Микроскопия в темном поле Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами света. Эти лучи не попадают в обьектив, поэтому поле зрения выглядит темным.
Если препарат содержит клетки микроорганизмов, то косые лучи, проходя через такой препарат, в значительной степени отражаются от поверхности клеток и настолько уклоняются от своего первоначального направления, что попа- лают в объектив. Тогда наблюдатель видит на черном фоне интенсивно светящиеся объекты, даже если их диаметр в 10 раз меньше, чем предел разрешения объектива. Такое освещение препарата достигается применением специального конденсора. Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю часть, поэтому центральные лучи света, идущие от зеркала, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных знутри конденсора (рис.
5.3). При микроскопировании в темном поле чожно увидеть объекты, величина которых Рис.5.3. Конденсортемного поля :.ззмеряется сотыми долями микрометра, т.е. ОИ-13 61 лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако наблюдение объектов в темном поле позволяет различить только их контуры, но не дает возможности рассмотреть внутреннее строение (рис. 5.4). Требования пря работе с темяопольпым копдеясором. Успешная работа с тсмноРис.
5.4. Схема хода лучей в конденсоре польным конденсором возможна только темного поля: при строгом соблюдении ряда условий. 1 — линза коиденсояа; 2 — черная пластинка, 1, Апертура темнопольного конденсозадерживающая центральные лУчи; 3 — обьекгив ра должна быль на 0,2 — 0,4 единицы боль- ше апертуры объектива (см. схему хода лучей в темнопольном конденсоре, рис. 5.4). В противном случае часть боковых лучей попадет в объектив, что вызовет частичное освещение поля зрения и снижение контраста, Поэтому наблюдение в темном поле ведут обычно с иммергированным конденсором, имеющим апертуру около 1,2, и сухими системами с числовой апертурой 0,65 — 0,85. Когда использукп обьектив с большей апертурой, то для получения четкого изображения объектив обязательно диафрагмируют, т.е.
снижают его апертуру. С этой целью в объектив, извлеченный из револьвера, вводят специальную вставную диафрагму, которая входит в комплект выпускаемых темнопольных коцпенсоров. Еше удобнее пользоваться объективами, снабженными ирисовой диафрагмой, расположенной между линзами. Вра~пением специального колыга, имеющегося на оправе, изменяют диаметр отверстия диафрагмы и тем самым снижают числовую апертуру объектива.
2. Накал лампы осветителя должен быть максимальным, так как темнопольный конденсор пропускает лишь незначительную часть поступающего светового потока, поэтому особое значение приобретает правильная установка света, максимальное его использование и особенно тщательная це~провка. 3. Толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, так как все кондепсоры темного поля имеют очень маленькое рабочее расстояние. В противном случае фокус конленсора окажется толще предметного стекла, а не в плоскости препарата, и наблюдатель ничего не увгщит. 4.
Следует обращать внимание на толщину и чистоту препарата. Чем толще препарат и чем больше в нем гюсгоронних частиц, преломляющих свет (пыль, пузырьки воздуха и т.д.), тем менее контрасгным получается изображение, так как каждая частица, отражая лучи, освещает поле зрения. В связи с этим для приготовления препарата используют тщательно очищенные предметные и покровные стекла. Порядок работы с темяопольяым коядеясором. 1. Препарат «раздавленная капля«, приготовленный на тонком и тщательно очищенном предметном стекле, помешают на столик микроскопа и фокусируют с объективом 8х.
После этого положение тубуса не меняют до фокусировки препарата с объективом 40х. 2. Вынимают свеглопольный копдснсор и окуляр, вывинчившот один из обьективов. В некоторых микроскопах может иметься одно свободное от объектива отверстие, закрытое специальной заглушкой, так что можно воспользоваться этим отверстием, вывинтив заглушку. 3. Закрыв диафрагму осветителя, фокусируют изображение нити лампы на зеркале, прикрьпом кружком белой бумаги, как при установке света по Келеру, Предварительно необходимо с помощью реостата уменьшить яркость света.
4. Открывают диафрагму осветителя. Прикрывают верхний конец тубуса микроскопа матовым стеклом (вместо окуляра) и, сле~ка поворачивая зеркало, добиваются равномерного освещения поля. После этою зеркало перемещать нельзя! 5. Вставляют окуляр и устанавливают объектив 8х. Осторожно, не задевая зеркала, устанавливают темнопольный конденсор таким образом, чтобы белый винт был обращен в сторону штатива микроскопа, а два регулировочных винта — в сторону осветителя.
Надевают на регулировочные винты ключи. 6. Препарат сдвигают в сторону, на верхнюю линзу конденсора наносят каплю иммерсионного масла и, несколько опустив конденсор, снова устанавливают препарат, закрепив его клеммами. 7. Поднимают конденсор вверх до соприкосновения масляной капли с предметным стеклом. Капля должна равномерно заполнить пространство между линзой конденсора и предметным стеклом и не содержать пузырьков воздуха. 8. Отключают реостат освсгителя, т.е. получают максимальное осветление. 9.
Глядя в окуляр, центрируют конленсор. Для этого с помощью регулировочных винтов приводят точно в центр поля зрения изображение светлого кольца с темным пятном в середине или только светлого пятна. 1О. Слегка полнимая или отпуская конденсор, устанавливают его в таком положении, чтобы в поле зрения исчезло темное пятно и осталось только замкнутое светлое пап ю. 11.
Ставят объектив 40» и фокусируют препарат. 5.1.3. Микроскопия с фазово-контрастным устройством Микроскопия с фазово-контрастным устройством основана на том, что с его помощью различия в фазе световых лучей, возникающие при прохождении их через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, в результате чего объекгы становятся контрастными.
Глаз человека выявляет различия в хчине волны света 1цвет) и ее амплитуде 1интенсивность, яркость), но не в состоянии заметить смещегще фазы. Неокрашенные клетки микроорганизмов хорошо видны в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа только в том слу гае, когда значительная часть энергии света, прошедшего через них, поглощается. При этом выходящая из объекта 1клетки) световая волна имеет меньшую амплитуду, т.е. яркость, и этот объект воспринимается глазом наолюдателя как более темный, коггграстный по сравнению с окружающей средой. Однако многие микроорганизмы, размеры которых лежат в пределах разэешающей способности микроскопа, мало отличаются по прозрачности (плотности) от окружающей среды.
Амплитуда световой волны, проходящей через клетки таких микроорганизмов, почти не меняется, поэтому объекты плохо различимы или даже невидимы в обычный светлопольный микроскоп. Поле ~реник кажется наблюдателю почти однородным. Объект можно сделать более контрастным, либо почти до предела закрьшая диафрагму конденсора, либо окрашивая клетки, либо меняя фазово-контрастное устройство. Первое нежелательно, так как снижает апертуру конденсора и тем самым заметно уменьшает разрешающую способность микроскопа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
