А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Препараты, работа с которыми закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе. Препират «раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю стерилизованной фильтрацией водопроводной воды, помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные и на плотной, и в жидкой питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей; выращенные в жидкой среде можно переносить также стерильной пипеткой.
В последнем случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы из-под покровного стекла не выступал избыток жидкости. Если он образовался, его необходимо удалить фильтровальной бумагой. При продолжительном изучении микроскопируемого объекта края покровного стекла рекомендуется залить лаком для ногтей, что предотвратит быстрое высыхание препарата.
70 Препарат «висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помешают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином.
Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за обьектом. Лля длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде. При работе с бактериями этот метод используется редко. Препарат «оптечаток».
Из агаризованной среды, па которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его па предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь нс сдвинуть в сторону. Полученный препарат помешают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1: 40) на предметное стекло.
Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Препарат «отпечаток» использутог в основном при исследовании спороношения стрептомицетов. Препарат «микрокультура» (пли «агаровая пленка»). На тонкое, простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2 — 0,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла. После застывания среды удаляют петлей лишний агар, оставляя два тонких участка пленки величиной с покровное стекло каждый.
В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микроскопированием на пленку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыхания пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом. Выращивание микроорганизмов непосредственно на предметном стекле позволяет вести микроскопическое наблюдение за процессами их роста и развития, изучать цикл развития, способ размножения (деление — почкование), влияние на эти процессы каких-либо агентов.
На препаратах не нарушается естественьюе расположение клеток в растущей микроколонии. Выращивание микроколонии можно проводить в аэробных или анаэробных (под покровнъгм стеклом, загерметизированным лаком) условиях. Агаровую пленку можно нанести на покровное стекло и приготовить препарат «висячая капля». На таком препарате можно наблюдать движение бактерий по типу сколыкения. 5.2.2.
Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высуитвание, фиксаиию и окраску. 71 Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное сгекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавленная капля . Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 — 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы быстро высыхал после приготовления. Выеушиваиие мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх.
Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшес прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами (см. приложение 5).
Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим расгвором. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивакп главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители— метиленовый синий, основной фуксин„гснциановый фиолетовый, кристалл- виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки.
Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключьпелыю основные красители. Различают простое и дифференциальяое окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашиванис выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаше всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим.
Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 — 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя. По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.
Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровалыюй бумагой, помещают на окрашенный 72 мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.
Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фнльтровальную бумагу. В правильно окрашенном н хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Форму клеток н их расположение (цепочкн, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) вьивляют, как правило„на препаратах «раздавленная капля» при светлопольной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий, таких как Яеггайа тагсезсепз, готовят препарат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание.
Клетки мелких бактерий, имеющих выросты — простеки (роды Саи1обасгег, 1абгуз, Ргоз(йесовисгоЫит, ЯеНа и некоторые другие), целесообразно исследовать методом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор н спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток». Необходимо помнить, что возраст кулщуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфолоппо и цитологию микроорганизмов.
5.2.3. Определение размеров клеток микроорганизмов Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с помощью окулярной линейки — микрометра или окулярного винтового микрометра. Для измерения лучше использовать живые, а не фиксированные клетки, так как фиксация и окраска приводят к некоторому изменению истинных размеров клеток. Размеры клетки удобно определять с помощью фазово-контраспюго устройства. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-го водного раствора агара. Размеры клеток выражают в микрометрах. Окулярвый микрометр (окуляр-микрометр) представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована линейка длиной 5 мм.
Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микрометр вставляют в окуляр. Для этого вывинчв вают глазную линзу окуляра, помешают на его диафрагму окулярный микрометр делениями вниз н завинчивают линзу. Однако только с помощью окуляр-микрометра нельзя непосредственно измерить величину клетки, так как последние рассматриваются через объектив н окуляр, а деления линейки — только через верхнюю линзу окуляра. Поэтому, прежле чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену деления окулярного микрометра для данного увеличения микроскопа. Это делают с помощью объективного микрометра.
Объективный микрометр (объект-микрометр) — это металлическая пластинка с отверстием в центре (рис. 5.9). В отверстие вставлено стекло, на которое нанесена линейка элиной 1 мм. Она разделена на 100 частей, т.е. деление объективного микрометра соответствует 0,01 мм, или 10 мкм. Для определения цены делений окулярного микрометра объективный микрометр помещают на столик микроскопа и фокусируют при малом звеличении. Изображение линейки перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при которо»1 будут определяться размеры клеток. Пере- 73 Рис.
5.9. Объективный микрометр: а — общий вид; 6 — ввд пол микроскопом мешая столик микроскопа и поворачивая окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна перекрывала другую. Цену деления окулярного микрометра определяют по принципу нониуса, т.е. совмещают одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров и находят следующее их совмещение. Устанавливают, скольким делениям объективного микрометра соответствует одно деление окулярного микрометра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
