А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Например, 2 деления объект-микрометра 120 мкм) соответствуют 5 делениям окуляр-микрометра. Следовательно, одно деление окуляр-микрометра равно 4 мкм (20: 5). Если теперь на столик микроскопа поместить препарат с клетками микроорганизмов и рассматривать его при том же увеличении, то можно измеригь величину клетки. Для этого определяю~, какому числу делений окулярной линейки соответствует величина измеряемого объекта, и умножают это число на цену деления окулярного микрометра. Удобно определять размеры клеток с помощью винтового окулярного микрометра МОВ-1-15.
Винтовой окулярный микрометр закрепляют на тубусе микроскопа, предварительно вынув окуляр. В окуляре винтового микрометра имеется неподвижная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрестием. Пластинка связана с микрометрическим винтом-барабаном и перемешается вместе с перекрестием при его вращении. Для измерения длины клетки вращением микрометрического винта-барабана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножают полученное значение на цену деления барабана при данном увеличении микроскопа.
Цену деления барабана для каждого объектива определяют с помощью объективного микрометра. С этой целью подводят перекрестие к началу одного деления объективного микрометра и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перскрестие до конца деления объективного микрометра и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует одно деление объективного микрометра.
Например, одно деление объективного микрометра, т.е. 1О мкм, соответствует Хделениям микрометрического винта-барабана; следовательно, одно деление его при данном увеличении микроскопа равно 10: Х [мкм!. Для получения достоверных результатов необходимо измерить не менее 20— 30 клеток. При определении размеров клеток округлых форм измеряют их диаметр, у клеток других форм — длину и ширину; указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т.е.
минимальные и максимальные размеры. 5.2.4. Выявление клеточных структур и запасных веществ Капсулы. Клетки многих микроорганизмов, особенно при росте на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым внешним слоем — капсу- лой или слизью. Эти струкгуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким-либо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются„а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата.
Чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски 1негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с обьективом 40х.
На общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветныс капсулы, окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет. Кроме того, существуют специальные методы окраски капсул, один из них приведен ниже. Выявление капсул по методу Гипса. На конец предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее клетки, хорошо перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок по всей поверхности предметного стекла. Мазок высушивают ца воздухе и фиксируют 5 — 10 мин смесью Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом.
Далее мазок окрашивают карболовым фуксином Циля„разбавленным водой в соотношении 1: 3. Время окрашивация — 2 — 3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсиоцной системой. На темно-сером фоне препарата контрастно вьщеляются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами.
Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо видно лишь при электронной микроскопии. Для наблюдения клеточной стенки при световой микроскопии применяют метод темного поля либо специальную окраску, с помощьк~ которой удается легко выявить границы между отдельными клетками, расположенными в виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном стекле делают мазок клеток исследуемых бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5%-м раствором фосфомолибленовой кислоты. Затем препарат промывают водой и окрашивают цс более 15 с 0,02%-м раствором кристаллвиолета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Клеточная степка окрашивается в черный, а цитоплазма в бледно-сиреневый цвет. Можно использовать метод окраски клеточной стенки по Гупптейну. Мазок выдерживают 15 мин в жидкости Карнуа, протравляют в течение 25 мин 10%-и водным раствором таннина, промывают водой и окрашивают водным фуксином или 0,02%-м раствором кристаллического фиолетового в течение 30 — 60 с. Затем препарат промывают, высушивают и микроскопируют с иммерсией.
Окраска по Граму. С молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки связывают способность бактерий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При пос- 75 ледующей обработке фуксином или сафранином они приобретают розовую окраску. По Граму рекомендуется окрашивать клетки молодых, чаще всего суточных, культур, так как способность удерживать краситель зависит от физиологического состояния бактерий. Например, некоторыс бактерии после прекращения активного роста теряют способность окрашиваться по Граму. Окраска по Граму заключается в следующем.
На одном обезжиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в центре — мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа — контрольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть грамположительными (например, ЛЛсгососсиз 1и~еиз или Васйиз сежпз), другой — грамотрицательными (например, Езспег1сИа сой). Мазки следует готовить тонкими, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений.
Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 — 2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его 1 — 2 мин раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обссцвечивакл в течение 0,5 — 1,0 мин 96%-м этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают ! — 2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правилыюм окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные розово-красный цвет. Выявление кнслотоустойчивостн клеток.
Кислотоустойчивость — свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий: при обработке кислотой их окраска сохраняется. Кислотоустойчивость обусловлена особенностями химического состава клеточной стенки этих бактерий — высоким содержанием в ней сложных липидов и, в частности, наличием миколовых кислот.
Наибольшее распространение получил способ выявления кислотоустойчивости по Циль — УХильсепу. На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобакгерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помешают филътровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и затем 2 — 3 раза подогревают до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки.
За появлением паров наблюдают, глядя па мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. Дают препарату остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-м раствором НзЗО,. Для этого предметное стекло погружают 2 — 3 раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Вновь тщательно промывают препарат волой и докрашивают 3 — 5 мин метиленовым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые — синий. Кислотоустойчивость можно определить у клеток любого возраста.
Жгутики. Способность к движению у большинства микроорганизмов обусловлена наличием жгутиков. Расположение и количество их у различных бактерий варьирует и имеет лиапюстическое значение. Особенно важен этот признак для идентификации палочковидных грамотрицатсльных бактерий. По ха- 7б рактеру движения бактерий в препарате можно предположительно судить о типе жгугикования. Если жгутики расположены на одном или на двух полюсах клетки, то движение обычно очень быстрое — «ввинчивающееся», без покачивания из стороны в сторону; при латеральном или перитрихиальном расположении жгутиков клетки двигаются плавно, совершая колебательные отклонения от оси движения. Отдельный бактериалытый жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если не окрашен особым способом, который увеличивает его кажушуюся толщину.
Так, диаметр отдельных жгутиков колеблется в пределах 0,01 — 0,02 мкм (у Вг1е1гот«Ьпо 0,04 — 0,0б мкм), а максимальное разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Лишь у немногих бактерий, например у представителей рода Яр(грит, пучки жгутиков достаточно плотны, и их удается обнаружить при наблюдении в светлом поле с помощью фазовоконтрастного устройства илн в темном поле. Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они основаны на использовании различных «протрав» (состав см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
