А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Время инкубации на втором этапе и окрашивающий титр определяют экспериментально. После этого препарат осторожно промывают и микроскопируют при увеличении 90х. Непрямой метод обладает принципиальным преимуществом, так как даже при наличии лишь одной люминесцирующей сыворотки можно отыскать больпюе число разных антигенов, используя стандартные кроличьи сыворотки. При непрямом методе, однако, крайне важен контроль, включающий инкубирование препарата на втором этапе непосредственно с меченой сывороткой; обработку препарата гетерологичной меченой сывороткой; обработку препарата на первом этапе нормальной или гетерологичной сывороткой, не содержащей антител к исследуемому антигену. Обиаружение мелких колоний микроорганизмов. Мембранный фильтр марки «Синпор» с диаметром пор 1 мкм стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 20 мин.
Через фильтр пропускают исследуемый субстрат (воду, почвенную вытяжку) или суспензию микроорганизмов. Фильтр накладьпиют тыльной стороной на агаровую пластинку с элективной питательной средой и помещают на 5 — б ч в тсрмостат. Затем фильтр с колониями снимают со среды и кладут тыльной стороной на дно чашки Петри, содержащей несколько капель флуорохрома, или диск фильтровальной бумаги„смоченный раствором флуорохрома, например акридина оранжевого, в разведении 1: 5000. Диффундирующий через фильтр флуорохром в течение 5 — 10 мин окрашивает колонии микроорганизмов.
При необходимости фильтр накладывают на фильтровальную бумагу, смоченную физиологическим раствором, для удаления избытка флуорохрома. Фильтры просматривают в синем свете. Микроорганизмы остаются живыми и могут быть использованы для дальнейшего выращивания и изучения. 5.4. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ И СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ 5.4 1.
Просвечивающая электронная микроскопия Электронная микроскопия является неотъемлемой частью микробиологических исследований уже три четверти века. Приборостроительные компании выпускают много типов электронных микроскопов, отличаютцихся принципом действия, разрешающей способностью и диапазоном рабочих увеличений. В практике микробиологических исследований первыми были применены просвечивающие, или глраисмиссоопные, злекюровные микроскопы (ТЭМ), которые даня возможность визуально изучать только очень тонкие срезы или частицы с увеличением до 100 тысяч крат. Можно использовать и более высокие увеличения, но новые структуры биологических микрообъектов при этом уже не обнаруживаются. Вместо светового излучения в ТЭМ используют пучки ускоренных электронов, обладающие волновыми свойствами, причем эквивалентная длина волны таких пучков (длина волны Де-Бройля) на несколько порядков меныпе све- 83 товой, по обусловливает намного большую разрешающую способность электронных микроскопов этого типа.
Практически (для биологических объектов) ее величина для ТЭМ составляет 0,5 нм, причем этот предел определяется не характеристиками самого ТЭМ, а толщиной ультратонких срезов, при которой изображение имеет достаточный контраст. В оптимальных условиях (на сверхтонких монокристаллических пленках) достигается разрешение 0,1 нм. Основной частью ТЭМ является вакуумная колонна (электронно-оптическая система), в которой последовательно, сверху вниз, расположены и точно съюстированы относительно общей оси симметрии (оптической оси): .
° электронная пушка с катодом и анодом, обеспечивающая эмиссию и ускорение электронов; ° две конденсорные магнитные линзы, управляющие диаметром электронного пучка; ° объектный столик, обеспечивающий медленное и плавное персмещение образца; ° три или четыре магнитные линзы, Формирующие увеличенное изображение; ° вспомогательные устройства (дефлекторы и стигматоры) для точной юстировки системы; ° люминссцирующий экран для наблюдения увеличенного изображения.
Средняя часть экрана может подниматься для точной фокусировки изображения с помощью дополнительного 10-кратного бинокулярного микроскопа и для пропускания пучка„несущего изображение, в фотокамеру; ° фоюкамера (пленочная или цифровая). В вакуумной колонне с помощью вакуум-насосов создается глубокий вакуум для предотвращения рассеяния электронов и обеспечения условий работы накаленного катода. Источник электронов (катод) — это вольфрамовая нить, накаливаемая электрическим током до высокой температуры, при которой возникает электронная эмиссия. Между катодом и анодом (металлическим диском с отверстием в центре, расположенным под катодом) подается высокое ускоряющее напряжение (50 — 100 кВ), благодаря чему пучок ускоренных электронов направляется вниз, в сторону образца. При этом электронный луч, сфокусированный конденсорными линзами, направляется на образец.
Биологические объекты, исследуемые в условиях вакуума и электронного облучения, должны быть зафиксированы и обезвожены, а для повышения контрасгности изображения еще и обработаны соединениями тяжелых металлов, т.е. химически контрастированы. Прошедшие через тонкий объект электроны попадают в магнитное поле объективной магнипюй линзы, формируюшей первичное увеличенное изображение объекта. При этом электроны, рассеянные микроучастками образца с более высокой электронной плотностью (насыщенными тяжелыми металлами с целью контрастирования), в большей степени отклоняются магнитным полем и задерживаются объективной диафрагмой. Таким образом, они не попадают на люминесцентный экран, и участки изображения, соответствующие таким микроучасткам объекта, выглядят темными.
Контраст изображения может быль обусловлен также и поглощением электронов электронно-плотными микроучастками объекта, но поглощение электронов сопровождается повышением температуры объекта, что приводит к тепловому дрейфу и даже к разрывам срезов и пленок-подложек, поэтому при подготовке срезов следует избегать их чрезмерной толщины, а также тщательно отмывать неспецифический осадок контрастирующих веществ. Первичное увеличенное изображение, сформированное объективной линзой из электронов, летящих близко к оптической оси (слабо рассеянных объектом и не задержанных объективной диафрагмой), имеет увеличение около 1000 крат, но его разрешение настолько высоко, что позволяет увеличить его дополнительно до 100 тысяч крат с помощью промежуточных линз (обычно их 2) и проекционной линзы.
При этом становятся видимыми все новые детали микроструктуры. Проекционная линза, кроме того, обеспечивает большую глубину фокуса, необходимую ддя сохранения резкости изображения на поднятом экране и на фотопленке. Любой современный научный прибор снабжается блоком фиксирования полученной с его помощью информации.
В электронных микроскопах это— фотографирование объектов на фотопленку и их оцифровка компьютерными системами. Специальные программы обработки изображений позволяют нс золько сохранять их в виде графических файлов, но и гибко корректировать их контраст. Это очень важно для ТЭМ, где оптимальное контрастирование биологических обьектов остается одной из главных проблем. Оцифровка позволяет также увеличить число отснятых кадров за сеанс микроскопии с 2 — 3 десятков негативов, получаемых с помощью фотографирования, примерно до сотни цифровых изображений.
Необходилю, однако, отметить, что для получения цифровых изображений высокого разрешения требуются дорогостоящие специализированные пифровые фотокамеры, а объем полученных файлов измеряется десятками мегабайт. Подготовка образцов для исследования в ТЭМ вЂ” это почти всегда достаточно сложный процесс (исключение — простые методы контрастирования микроорганизмов, которые будут описаны далее), состоящий из ряда обязательных стадий, а также множества модификаций, разработанных в целях лучшего выявления особенностей строения отдельных объектов. Обязательны фиксация, обезвомсивание, заливка специальными смолами, получение ультратонких срезов, контрастироеание. Цель фиксации — сохранить вид объекта в состоянии, по возможности близком к прижизненному. 1-1аиболее полно фиксация осуществляется с помощью обработки объекта растворами глутаральдегида и четырсхокиси осмия ОзОл.
Эти вещества образуют поперечные связи между различными молекулами в клетке, благодаря чему возникает прочная сеть, которая предотвращает или замедляет потерю включенных в нее веществ при обезвоживании и дальнейшей обработке. Чстырехокись осмия не только фиксирует клетки, но и контрастирует отдельные их компоненты„прежде всего фосфолипидные мембраны и жировые включения, которые во время фиксации поглощают наибольшее количество осмия и поэтому приобретают способность сильно рассеивать ускоренные электроны. Для преимущественного четкого выявления мембран используют перманганат калия КМп04 связывающийся с фосфолипидами. Пермапганат калия плохо фиксирует белки и не удерживает большинство других компонентов клетки, кроме мембран. Для обезвоживания применяют водные растворы этанола возрастающих концентраций.
В процессе фиксации и особенно обезвоживания могут терять не- которые компоненты клеток. Поэтому часто полезно готовить один и тот же объект к исследованию в ТЭМ, Фиксируя его различными способами. Например, для изучения мембранотропного действия на микроорганизмы некоторых антибиотиков и других соединений целесообразно зафиксировать клетки как универсальным способом, описишым далее, — с помощью глутарового альдегида и четырехокиси осмия, так и с помощью 4%-го раствора перманганата калия, и сравнить вид срезов в ТЭМ. Для получения улгпратонких (не более 0,1 мкм) срезов клеток, через которые может пройти электронный луч ТЭМ, фиксированные обсзвоженные клетки пропитывают полимерными (часто эпоксидными) компаундами — «смолами».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
