А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 22
Текст из файла (страница 22)
в приложении 4), осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увеличивается и они становятся видимыми под световым микроскопом. Окраска жгутиков требует тщательной подготовки клеток и аккуратности в работе, так как они легко обламьгваются даже при легком взбалтывании суспензии.
Окраска жгутиков по методу Леффлера в модификации Пегвкова. Бактерии, предназначенные лля окраски жгутиков, ежедневно в течение 2 — 3 дней пересевают в свежую жидкую или на плотную среду, содержашую не более 1,5% агара. Для окраски используют клетки 12 — 16-часовой культуры. Клетки осторожно берут петлей и переносят в пробирку со стерильной водой, подогретой до температуры, при которой их выращивали. Прежде чем делать мазок, каплю полученной суспензии просматривают под микроскопом и убеждаются в том, что клетки подвижны и плотность суспензии невелика: 5 — 10 клеток в поле зрения.
Клетки легко теряют жгутики в момент приготовления мазка, поэтому необходимо ооращать внимание на чистоту стекла и способ нанесения на него суспензии. Предметные сгекла должны быть тщательно обезжирены. Непосредственно перед приготовлением мазка стекло 3 — 4 раза проводят через наиболее горячую часть пламени горелки. Лают стеклу остьпь и пастеровской пипеткой, пером перьевой ручки или петлей нано:ят 3 — 4 маленькие капли культуры на стекло. Капли должны хорошо расплываться по =теклу и быстро высыхать.
Высушенный мазок заливают протравой. Необходимо слелить, чтобы протрава не подсыхала. Через 15 мин протраву смывают дистиллированной водой и препарат окрашивают в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раствор красителя. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют с иммерсионной системой.
Обращают внимание на раслоложение жгутиков, их количество и длину. По другому методу препарат заливают протравой через воронку с фильтром и трижды з течение 3 — 5 мин нагревают стекло над пламенем горелки до появления паров. Затем ..ротраву сливают и препарат заливают через воронку с фильтром раствором Циля на : — 1О мин.
Нуклеоид. Обнаружить нуклсоид в бактериальной клетке при помоши светового микроскопа трудно. Основные красители, избирательно окрашивающие ;роматин ядер эукариотичсских клеток, равномерно и интенсивно окрашивагзт всю прокариотную клетку. Для избирательного окрашивания пуклеоида зиксированные клетки предварительно обрабатывакп рибонуклеазой или раз- 77 бавленной соляной кислотой, чгобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виас плотных тел, имеющих неправильные очертания и расположенных в центре или на обоих полюсах клетки.
Довольно четко нуклеоид обнаруживается у следующих бактерий: Рго!еиз ги!япт, Аго!оЬас!ег сЬгоососсит, Впсг!!из теяпгепит, В. сеювию тп тусоя!ез, В. хцЬВ!и. Для выявления нуклеоида на предметном стекле дслакл мазок суточной культуры бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 2 — 3 мин в парах 2%-го раствора осмиевой кислоты. С этой целью на дно чашки Петри наносят 2 — 3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают мазком вниз на обрезки стекла над фиксатором. По окончании фиксации препарат опускают на 2 — 3 мин в стаканчик с раствором 1 и.
НС1 для гидролиза рибосомальной РНК. Стакан держат на водяной бане при 60 'С. После гидролиза препарат немедленно промывают водой. Затем мазок помешают на 15 мин в 1%-й раствор формалина, вновь промывают водой и окрашивают в течение 1 — 2 мин 0,1— 1,0%-м водным раствором основного фуксина. Препарат промывакп, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид — в ярко-малиновый. Многие микроорганизмы содержат различные внутрицитоплазматические включения: это могут быть продукты метаболизма, «складирующиеся» внутри клетки, структуры, необходимые для энергетического (хлоросомы зеленых бактерий, в которых находятся бактериохлорофнллы, фикобилисомы циацобактерий, содержащие пигменты фикобилипротеины) и конструктивного (карбоксисомы автотрофов, состоящие из ключевого фермента цикла Кальвина— рибулозодифосфаткарбоксилазы) обмена веществ.
Некоторые включения имеют приспособительное значение — это, например, газовые вакуоли, необходимые для поддержания плавучей плотности водных микроорганизмов и магнитосомы железобактерий, содержащие магнетит (РсэО«), который позволяет бактериям перемещагься в направлении линий магнитного поля. Разнообразными соединениями представлены запасные полимерные гранулярпые цитоплазматические вещества микроорганизмов, которые они накапливают внутри клетки. Чаще всего это полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), липиды, полифосфаты.
Некоторые бактерии накапливают в клетках серу. Резервом азота являются цианофицицовые гранулы цианобактерий. Гранулы углеводиой природы (полисахариды) выявляют при обработке клеток раствором Люголя. Для этого к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляют каплю раствора Люголя. Препарат накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гранулы крахмалоподобных веществ — гранулезы— окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов — в красновато-коричневый цвет. Гликоген при окраске Люголем легко выявляется у дрожжей, гранулеза характерна для бактерий рода С(оз!гЫ!цт.
Реакция на гликоген хорошо проходит только в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорганизмы, подкисляют. Липидвые граиулы. У дрожжей и мицелиальных грибов запасные липиды представлены нейтральными жирами, которые легко обнаруживаются в живых клетках без специальных методов окраски в виде силыю преломляющих свет капель. Бактерии в качестве резервных лшщдов образуют поли-р-оксимасля- ную кислоту.
Гранулы поли-(1-оксибутирата хорошо заметны при микроскопировании живых бактериальпых клеток с фазово-контрастным устройством, однако чаще для их выявления клетки окрашивают лиофильными красителями — суданом 1П или суданом черным. Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фиксируют в пламени горелки. Заливают поверхность мазка раствором судана черного и оставляют краситель на 5 — 15 мип.
Избыток красителя сливают, просушивают препарат фильтровальной бумагой, просветляют в ксилоле, погружая в него несколько раз предметное стекло. Время просветления препарата не должно превышать 1 мин. После этого клетки дополнительно окрашивают в течение 10 с 0,1%-м водным раствором сафранина. Более длительная обработка сафранином нежелательна, так как маскируется основная окраска.
Гранулы поли-0-оксибутирата окрашиваются в темный цвет, остальная часть клетки — в розовый. Полифосфаты (волютин и метахроматин). В клетках прокариот волютин локализован в цитоплазме, в клетках эукариот — в вакуолях. Окраска волютиновых гранул основана на свойстве метахромазии — способности вызывать изменение цвета некоторых красителей (метиленовый синий, толуидиновый синий).
Готовят тонкий мазок клеток, высушивают его на воздухе и фиксируют в пламени горелки. На фиксированный мазок наливают мстиленовый синий по Леффлеру и окрашивают клетки в течение 10 мин. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки окрашиваются в голубой цвет, а зерна волютина — в фиолетово-красный.
Волютин легко выявить окраской по способу Омелянского, основанному на его плохой растворимости в растворах кислот. В этом случае на фиксированный в пламени горелки мазок наливают карболовый фуксин Пиля и окрашивают клетки в течение 0,5 — 1,0 мин. Краску сливают, промывают препарат водой и обесцвечивают 1%-м раствором Н2БО„в течение 20 — 30 с. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 20— 30 с метиленовым синим (1: 40).
Снова промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании гранулы волютина имеют красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы. Для выявления волютина у дрожжей применяют следующий способ. Фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение 3 мин. Краситель сливают, препарат промывают водой и, не высушивая, наносят на мазок неболыцую каплю 1%-го раствора серной' кислоты; мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Волютин имеет вид капель сине-фиолетового цвета на слабо-голубом фоне цитоплазмы. Включения серы встречаются у бактерий, чей метаболизм зависит от этого соединения. Так, сера является источником энергии для аэробных тионовых бактерий, окисляклцих сероводород, и донором электронов для анаэробных фотосинтезирующих бактерий.
Благодаря двойному лучепреломлению включения серы хорошо заметны в клетках без специального окрашивания. Они растворяются при обработке клеток абсолютным спиртом, сероуглеродом или ледяной уксусной кислотой. Парасноральные включения. Бактерии Васй!из йиг1ля1елзи, включающие более 80 подвидов, образуют параспоральные включения примерно в тот же пе- 79 риод, что и споры. Обычно эти включения состоят из нескольких полифункциональных белков — высокоспецифичных токсинов некоторых беспозвоночных животных, также проявляющих менее специфическую антимикробную активность. В состав некоторых включений могут входить и другие белки, например цитолитические. В клетке образуется от одного до нескольких включений разных размеров, часто имеющих форму бипирамид, ромбоэдров, пластинок-параллелепипедов, ромбоидов, а также неправильных глыбок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
