А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Одной из замечательных особенностей СЭМ является и большая глубина резко изображаемого пространства (глубина фокуса), которую можно к тому жс усилить путем наклона объектного столика (до 45") и с помощью динамического фокусирования. Это имеет особое значение при изучении морфологии микроорганизмов, вьы явления их поверхностных структур, формы и архитектоники расположения клеток в пространстве, например в колониях, конгломератах. При использовании традиционных сканирующих электронных микроскопов объект должен быть 4пксировап, обезвожен и высущен с помощью мелподов, щадящих его поверхносвь, так как он подвергается воздействию глубокого вакуума (10 мм рт. ст.), интенсивной бомбардировке ускоренными электронами подобно тому, как и в просвечивающем электронном микроскопе (ТЭМ).
Ускоряющее напряжение для СЭМ меньше, чем для ТЭМ: обычно 10 кВ, нс более 20 кВ. Фиксация и последующая обработка объектов для изучения их с помощью СЭМ включает меньше стадий, чем для ТЭМ. В еще большей степени облегчается фиксация микроорганизмов, имеющих рипцплуло клеточную стенку. При СЭМ в качестве регистрируемого вторичного излучения выбирают прежде всего вторичньле электроны, т.е. электроны внешних оболочек атомов вещества изучаемого объекта, напылснного металлом. Такие электроны легко фокусируюзся и могут покинуть изучаемый объект только из тонкого (10 нм) поверхностного слоя вблизи моста бомбардировки, что и обеспечивает высокую разрешаюлцую способность СЭМ, которая,.
однако, меньше, чем для ТЭМ. Предельное разрешение в СЭМ обычно достигает порядка 10 нм при использовании вольфрамового термокатода (что соответствует полезным увеличениям в 50 — 60 тыс. раз) и порядка 5 нм со специальными электронными пушками повышенной яркости. В большинстве случаев ддя изучения морфологии микроорганизмов бывает достаточно увелллчений в 5 — 25 тыс.
раз. Следует помнить, что разрешающая способность при СЭМ в значительно большей степени зависит от выбранного режима работы микроскопа и способа подготовки образца, чем при ТЭМ, так как в формировании изображений участвует нс только элсктронно-оптическая система, но и система регистрации вторичных излучений. Поэтому разрешающая способность для каждого препарата, изучаемого с помощью СЭМ, определяется, помимо параллетров оптической системы„величиной отношения сигнал/шум. Для увеличения этого соотношения и соответственно разрешающей способности исполь~чот несколько компромиссных приемов, в частности стараются приблизить свойства образца к оптимальным лля исследования его поверхности в СЭМ (идеальна твердая, сухая, тепло- и элсктропроводная повсрхность) за счет фиксации.
Чаще всего используют химическую 4иксацию, подобную применяемой для подготовки образца к ТЭМ. При этом фиксация глутаровьлм альдегидом обязательна, а применение четырехокиси осмия желательно, но не обязательно при фиксации микроорганизмов, имеющих ригидную клеточную стенку. Обезвоживание — обязательный этап, если не используются низковакуумные СЭМ, о которых будет сказано далее.
Обезвоживание существенно ослабляст действие сил поверхностного натяжения на границе раздела жидкость— воздух и тем самым предохраняет повсрхность-мишснь от деформации этими силами при высушивании. Высулиивание необходимо для последующей подго- толки объекта к исс.гелованню в СЭМ в условиях высокого вакуума. Оно должно обсспечшь улатгенис всех жплкцх компопсьпов из образца Эгот этап может привести к нарушению сохранности поверхности (нарушению рссничек, микражгрсинок, обгцсму сжатию клеток, форми)юшнию ложных морфологических сгруктур). Поэтому прн СЭМ часто вьгсушггшнп образцы щэдягцим их пошрхиош ь мемедом емгушиеаяия в хрэлшческсй мочке (ВК12. й!шел ВКТ основан на переходе жгшкости, пропитывающсй образец, в газообразное состояние сразу по всему обтеьгу, а не испарением с поверхности, как при высушивании на воздухе. Этого обычно досыпают при повышенном давлении.
Ислень~юг специальную толстое ~энную сны ьную камеру, «уда т~омсшшот образец в абсолютном (безводном) ацетоне. Малейшее повыпюннс температуры свьппс критической приволит к переходу жидкости в гэз, и таким образом образец огшзывается высушенным сшют в полном объеме, а не при испарении жидкосш через поверхность Затем мспленно,нс допуская «ондснсацлн гази, снижаютдавшнис ло атмосферного. Выс)щиванис объектов впзможно и ппсле быстрого глубокого их замораживания в условиях„козла нс успеглют образоакпся крути~ага кристаллы лым, разрушающие поверхность (ггапримср, в языком азоте в присутствии криопротекторов — этвнола, эпшогга). После высутпиванил образцы прикрсплякп к специальным нсмацпцньш объектныьг столикам (из шпомпнисвых сплавов или латуни) с помощью лэкз для ногтей нли двусторонней клейкой пленки скотч, созлзюшнх ровный бесструктурный фон.
Наибгшсс удобно прпкрепллть к объектному столику образцы, фиксированные иа покровных стсктах Послелний швп полготоаки к псслеаоэанию поверхности обгжзпов, который пбычно проволлт на слелующий день после прнклсиванил, — лаистелле па них свсрлтонкой (нс более 20 пм, пабы не исказить картину микрорелмх)а на болыпих увеличениях) «ленка сгмаеое золою/палладий или платиг гагггалладий. )(ля напмт ния этих ишг подобных электро проводных покрыпгй нсполвцют мелюд еаюзмлогг иглармгия, а в последние годы — более дешевый и быстрый ягемод иоллосе раслызелия, обеспечивающий образование лвспсрсных элсктропроводпых покрытий за (О мин прн распылении металла в вакууме в срелс нонизиртванного аршна.
Кроме пожвмесгно ггритгегаемой миги ксьой фиксации объекта и последую шггг опишнных опсрапий его подготовки к СЭМ разрабошн и ботев когхпкий пугк фгзачмкля флигели сбмь та ют си заиоражиеляия и канавам нп лшэрелшллдо лоеедшоаль мета ышгсхогэ гпхрммшс Олнэко этот пуп трсбуег поцлсржания низкой теьгпсрпурьг в течение гссго периода исследования. Поэшму чаще образец подменяют рспднкой — точным слепком с его замороженной повегжносги.
В гюслсгшис злы часто используют путь изменения конструкции или режимов работы СЭМ гасим образом, побы можно было наблюдать обьекты без лредларитегьяой флксиипи. Созданы ннзкогюльтные ггизкоаакууьпгые СЭМ ((ОБЕМ), позжпмющие исслеловать влагосодер;кашне и неэлеьтропроводные обьекты. Такие приборы еще назыгиюг микроскопами с переменным давлением (УРВЕМ), шк как в ю; ласк цюнной гтушке и линзовой части ковша гы давление в мм рт ст. может изменяться аг вакуума, необходимого для традгпгиотпгой работы СЭМ (на уроыгс (О мм рт. ст.) ло практически шмосфсриаго, что позноляст исследовать в течение нескольких лесятко в секунд даже поверхности жидкостей 90 и живьгх сбьектов, пслутюгрул,енных в гшгдкую среду.
Причем в таких условияк отношение с««гнал/пгум значительно возрастает за счет раза ншке и вторичных элекцюнов и усиления сигнаяа, несущего ннфорьшцию о микрорехьефе поверхности благодаря ионизацни мсаекул остаточных шзои. В резюгьтате повышается чегксегь и дшжизавия изображения поверхности изучаемого обьегпв, Всвможнссти СЭМ могут быть расширены с помощью спекцюметрических присшвок, позволяющих оценивать различия в химическом сссшве микроучасзков поверхности сбьектов.
Рентгеновская и Оже-элекцюнная спекпзометрии на бюе СЭМ являютвя зксггресс-мшодами нерщрушающсго локадьного химического микроаназиза. Использование в СЭМ проходя ппы электронов лля исследования тонкопленочньы сбшз«гов и срезов известно как трансмиссионно-сканирующая электронная микроскопия. Она пгввояяег полз впь четкие (с разрешающей способностью до 3 нм) изобрюкения таких срезов, какие нсвозмож. но изучить в ТЭМ из-за резкого у«удше пня разрешающей способности за счет «роматичсской аберрации н татлового разрушения срезов.
Созданы глюке сканирующие приставки и для ТЭМ. С помощыа СЭМ можно получазь стсреомикргх(хтограф«ггг, цо позволяет рассчитывать испншые расстояния ««ежду гочкзь~и изображвнноц поверхности и восстанавливать взаимное расположение структур, в том числе и микробных клеток. в пространстве.
Приготовление препаршвв к«сток микроорганизмов для и«исследшиния в СЭМ удобнее всего ссуществляп, помещая такие клетки, обычно предварительна промьпые в 0,1 М фгюфягном буферном !метеоре, рН 7,0 -7,2, на обезжиренное покровное стекло. В таком случзе не потребуется много раз, после калглой смены распоря, проволнть цснтряфугирование обрззца, кзк это делаем» при обработке препаратов в цснтрифужных прсбирых. Олнако последний шриант также использукгг, особенно котла сб«екты после фиксации глушровым альдегилом шюхо пргшрепяявлся к покровным стеклам.
Влажные сбьекты щзмажяшют неравномерным слоем на покровных сгектал, ко«орые помешают в с~еютянную чашку Петри, и осшрол;но заливают их юнким, но по гнссгыо ггокрьгшюпгим слое«г 2,5-. 3%-го распюра глушрового альдегцдэ на вышеуказанном фосфшном буфере комнш ной температуры. Если исследуемые милрсорщнизмы и«геют лес«а«очно пжпную поверхность, п«можно высушить на покрошгом стекле, а эащм зялитыпутэровым альдеппюм в чашках Пшри Залитис образцы сстаьлшьж дл» фиксации в .ге«шоте, сбыюю на 1 — 2 ч.
Затем очень осторожно сливают раствор глутарового ачьлепгла и лшллы промышют образцы, закрепившиеся на покровных стеклах, фсефатным буфером, ка'хдый раз через 10 15 «шн ыша я епь После мыс можно провслигь ссмиевую фнксацпю, особенно желательную при шулепин микоплазм, проюпластов, сфсропластов, а также некоторых грамотрицагельных бактерий и не имеющих клеточных стенок археб. Лля этого образцы заливави 0,5 !%-м водны«г раствором ОзО«н оставлякп при комнатной тьчпгерпу(ж в темноте на 1 — 2 ч. Затем прсмываьтг образцы три раза юлой.
Далее прсволят обсзвожишние образцов в водных !жспюрах этан ода возржлающих концегпрациб (Э), 30, 50. 70 %) по 15 —. 30 мин. В 70%-м этаноле образцы можно хранить в холодильнике втечение 1 — 3 нед. В 96%-м э«виоле и зшем в абссаютном спирте образны выдерживают обычно по 1 ч, после чего помепьпат пх в безводный (абсошопшй) ацетон (такой ацешн «ранится с добавлением ! — 2 % безншного Св504) и хрангп в холодильнике ло 91 высушишщия в критической точке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
