А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Наиболее употребительны такие компаунды, как Эпон, Лралдит и их смеси. Ультратонкие срезы готовят с помощью ультрамикротомов, используя стеклянные или алмазные ножи. Срезы помещакп на медные (в особых случаях никелевые или золотые), мелкоячеистые сетки диаметром 3 мм, предварительно покрытые тончайшими пленками-подложками из специальных полимеров — Формвара (поливинилформаль) или Бутвара (поливинилбутираль). (Эпон, Аралдит, Формвар, Бугвар — это не химические названия, а торговые марки фирм, производящих реактивы для электронной микроскопии.) Срезы большой площади и серийные срезы помещают на 3-миллиметровые бленды (лиски с одним круглым или овальным отверстием). В ТЭМ с повышенным (200 — 300 кВ) и сверхвысоким (!000 — 3000 кВ) ускоряющим напряжением можно исследовать сравнительно толстые (1 — 5 мкм) срезы'.
В сочетании с гониометрическими объектными столиками, позволяющими наклонять объектные сетки, эти микроскопы дают возможность получать стереоизображения структур при высоком разрешении. Изучение срезов клеток в различных видах ТЭМ дает возможность выявить множество деталей внутреннего строения микроорганизмов и особенности их взаимодействия. Для этого применяют предварительную обработку срезов на сетках, позволяющую достигнуть наибольшего коятрастироваиия — усиления контраста изображения раътичных участков объекта при связывании с ионами тяжелых металлов.
Основной механизм достижения контрастности изображения при ТЭМ вЂ” рассеяние электронов и их попющение объективной диафрагмой. Контрастирование биологических объектов проходит уже в ходе их Фиксации и проводки благодаря использованию четырехокиси осмия и уранилацетата, а усиливается при контрастировании срезов. Для увеличения контрастности срезов их обрабатывают следующими соединениями тяжелых металлов: 1) Оз04, взаимодействующим с полярными и С-С-группами липидов, ЯН- группами белков, что приводит не только к фиксации, но и к возрастанию контрастности компонентов клеток, содержащих белки и Фосфолипиды; 2) уранилацетат, реагирующий с белками и фосфатными группами нуклеиновых кислот и, соответственно, увеличивающий их контрастность; 3) свинец при высоких значениях рН и в присутствии хелатообразующих агентов — реактив Рейнальдса (пропись сто приготовления дана ниже); реагирующий с РНК и с ОН-группами углеводов, а также с восстановленным осмием; 4) вольфрам, иногда молибден, в виде раствора Ха или К соли Фосфовольфрамовой кислоты, молибдата аммония, обычно применянпся при негативном контрастировании клеток микроорганизмов.
Кратковременная обработка срезов уранилацетатом перед их обработкой цитратом свинца приводит к более интенсивному включе- нию свинца. Поэтому наиболее эффективно последовательное совместное применение соединений урана и свинца в качестве контрастирующих веществ, что приводит к значительному возрастанию контрастности срезов клеток, при этом в увеличении контраста принимают участие осмий, уран, свинец. Метод негативного конт1засти1зоваяия применяется для контрастного выявления деталей поверхности бактерий, вирусов. Это достигается благодаря погружению таких объектов в тонкую, быстро высыхающую пленку электронно-плотного вещества, которос не «окрашивает» объект, а создает вокруг него темный фон.
Чаще всего для этих целей используют разбавленные растворы фосфовольфрамовокислого натрия или молибдата аммония. В такую пленку можно заключать, без предварительного обезвоживания, только мелкие клетки или частицы: испарение жидкости из них в условиях вакуума при внесении в ТЭМ незначительно и происходит очень быстро. Метод дает возможность изучать морфологию клеток, их жгутики, пили, реснички, часто определяется толщина клеточной стенки.
Это также удобный способ наблюдения за изменением повсрхности клеток, их деградацией под действием ферментов, антибиотиков, поверхностно-активных веществ. Метод не позволяет выявить детали внугреннсго строения микроорганизмов — их можно изучать только на срезах. Для негативного контрастирования каплю негустой суспензии клеток наносят на сетки, покрытые формваровой пленкой-подложкой; примерно через 30 — 60 с лишнюю жидкость убирают фильтровальной бумагой. Далее наносят на сетки приблизительно на это же время 2%-й раствор фосфовольфрамата натрия или калия.
Можно использовать и 1%-й раствор уранилацетата, но он способен деформировать клетки при выпадении в осадок. Лишнюю жидкость также убирают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Иногда перед негативным контрастированием фиксируют клетки примерно от получаса до нескольких часов в парах 25%-го глутаральдегида. Если атомы тяжелых металлов присоединяются к структурным компонентам клеток, окрашивая их, говорят о яозитивяам окрашиваиии.
Подготовка срезов клеток для ТЭМ. Приведем один из способов. Суспензии микроорганизмов, срезы которых будут исследовать в ТЭМ, помещают в центрифужные пробирки с пробками. Желательно, чтобы количество материала было нс меньше 50 мг. Заливают раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере из расчета, чтобы концентрация их в пробирке составила 2„5% глугарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0 — 7,2, и оставляют в темноте при комнатной температуре на ! — 3 ч.
Затем суспензии центрифугируют при условиях, обеспечивающих хорошее осажлсние всех частиц, и ресуспендируют в вышеуказанном буфере для промывки. Промывку проводят трижды с интервалом примерно 15 мин. После каждой смены любого раствора суспензию осаждают центрифугировапием. Осадок ресуспендируют в 1%-м водном ОзО, и оставляют обычно на ночь.
Затем отмывают четырехокись осмия и проводят обезвоживание материала в этаноле возрастающих концентраций: 30%, 50% по 30 мин, затем 70% с 1%-м уранилацетатом. Обычно в таком растворе осадок оставляют на ночь в холодильнике. Далее суспензию проводят через 96%-й этиловый спирт, абсолютные спирт и ацетон (в каждом случае по 30 мин) с центрифугированием. По окончании проводки осадки оставляют на дне центрифужных стаканов и начинают их пропитку смолами. Пропизнкр смолами часто проводят, используя следующую смесы на 10 мл смеси: смолы Эпон 812 — 4,5 мл; О))БА — 3,5 мл; МИЛ вЂ” 2 мл; 1)МР (катализатор) — 0,2 мл.
Последний вносится только после пропитки образцов смесью смол без катализатора, когда их помещают в заливочные капсулы. Вначале приготовленную смесь без катализатора смешивают с ацетоном в соотношениях — смола:ацетон: 1: 3„1: 1, 3: 1, поочередно заливая этими смесями суспензии и каждый раз оставляя в них не менее чем на 1 — 3 ч, а обычно — на ночь или на сутки. Затем образцы выдерживают 1 — 3 сут в смоле без катализатора при комнатной температуре.
Эту смолу сливают, переносят осадки в заливочные капсулы и заливают образцы смолой с катализатором. В постепенно затвердевающсй слюле образцы выдерживают при 37 С (обычно в течение суток) и 60 С (2 сут). Микроорганизмы, заключенные в смолы, готовы для резки на ультрамикротомс после соответствующей заточки полимерных блоков. Срезы наносят на специальные сеточки, такие же, какие используют и для негативного контрастирования (в этом случае покрытие сеток формваровой пленкой не обязательно, хотя и желательно), и проводят контрастирование срезов 1%-м уранилацетатом в течение примерно 10 мин (следить, чтобы не выпадал осадок), а затем в реактиве Рейнольдса.
Прнгонювленне реактива Рейнольдеа и окрашивание нм тонких срезов микроорганизлтв для неследования в ТЗМ. 1,33 г нитрата свинца, 1,76 г нитрата натрия На,(СвНзОз) Н,О и 30 мл дистиллированной (а лучше бидисгиллированней) воды взбалтывают в мерной колбе на 50 мл и оставляют на 30 мин, периодически встряхивая. Затем добавляют 8 мл 1 М 1ЧаОН и доводят объем раствора водой до 50 мл, перемешивая его переворачиванием колбы.
Краситель устойчив при хранении в холодильнике в закрытой колбе в течение полугода. Сетки со срезами промывают перед окрашиваиием и после него в 0,02 М растворе НаОН. Время окрашивавия реактивом Рейнольдса 5 — 30 мии, при этом нужно следить, чтобы не выпал осадок. После окраски и окончательной промывки 0,02 М ХаОН сетки промывают, опуская их примерно 30 раз в дистизиированную воду.
Высушенные сетки готовы для исследования срезов микроорганизмов в ТЭМ. Следует подчеркнуть, что при всех способах подготовки объектов для всех видов микроскопических исследований необходимо: использовать только химически чистые реактивы и качественнузо дистиллировагптую воду; нужные растворы хранить в холодильнике; помнить о важности используемых буферов; многие этапы работы проводить в вытяжном шкафу.
5.4.2. Сканирующая электронная микроскопия В последние три десятилетия достипзуто много новых успехов в развитии скииируюн1ез1 электронной' микроскопии (СЭМ), которые существенно расширили возможности использования этого метода в микробиологии. В основу СЭМ положен принцип формирования изображения на экране электронно-лучевой трубки с помощью развертки, синхронной с разверткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого обьекта. При этом одновременно регистрируется ряд вторичных излучений, что обеспечивает высокую информативность и разрешающую способность метода СЭМ, с помощью которого изучаются морфология и структура поверхности различных объектов. Очень важно изучение рельефа поверхности отдельных клеток микроорганиз- мов или составляющих эти клетки структур, а также колоний, конгломератов, консорциумов, включающих больцюе число микроорганизмов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
