А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Люминесцентный микроскоп позволяет также исследовать объекты в видимой области спектра в проходящем и отраженном свете в темном поле. Устройство люминесцентного микроскопа и порядок работы даны в описании каждой конкретной модели и здесь не приводятся, Большинство ыикробиолог1гческих объектов рассматривают с объективами 40х или 100х. При переходе от обьектива меньшего увеличения к объективу большего увеличения соблюдают определенную последовательносп . Просмотрев объект с меньшим увеличением, ставят объектив большего увеличения.
Затем фокусируют препарат и вновь настраивают освещение, проверяя центричность и резкость изображения полевой диафрагмы и источника света. С иммерсионными обьективами используют соответственно дистиллированную воду и нелюминесцирующее иммерспонное масло (вазелицовое или сандаловое). 5 1.5. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Канфокальпая (софокусная) лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) позволяет наблюдать исследуемые объекты (ткани, клетки как растительные и ;кивотные, так и бактериальные) в их естественном состоянии, не подвергая обезвоживанию, и с разрешением не меньшим, чем это достигается при флуоресцентной микроскопии.
Микроскоп незаменим при исследовании биопленок, выявлении пространственного расположения бактерий н грибов на поверхности растений и почвепгпях частицах, а также для многих других целей, где требуется на микроскопическом уровне проанализировать ненарушенную структуру объекта. В основе КЛСМ используется схема флуореспентного светового микроскопа (ФСМ).
В отличие от традиционного светового микроскопа, в котором весь спектр светового пучка, отходящего от исследуемого образца, попадает в глаза исследователя или на пленку, лазерный луч в сканирующем лазерном микроскопе, управляемый посредством колеблющегося зеркала, рас|цепляющего луч, непрерывно и постепенно, линия за линией, сканирует заданную поверхность.
При этом каждый участок образца, возбужденный посредством луча лазера, флуоресцирует и испускает свет, который в цифровом виде регистрируется фотоумножителем (обычно в пределах 768 — 512 линий). В качестве лазера используются аргонокриптоновые ионные лазеры, обеспечивающие свет с длинами волн в интервале 488 — 512 нм. Используются лазеры и на основе других инертных газов: гелий-неоновые (543 нм), аргоновый (351 — 363 нм). Варьирозанием вида газа или смеси газов и энергетической интенсивности лазера можно ..олучить необходимую длину возбуждающего света. 67 Сфокусировзнные на препарате лучи Рис. 5.8.
Принципиальная схема коифокального лазерного сканирующего микроскопа В любом случае в фотоумножитель попадают только те лучи, которые были точно сфокусированы на образце. Все другие лучи отсекаются «конфокальным микроканалом». Наличие этого канала наряду с лазерным источником света существенно отличают КЛСМ от традиционного ФСМ. В результате «одного прохода» луча формируется только один плоский вид образца. В результате наложения серии таких «плоских» изображений формируется трехмерное изображение объекта, при этом оно формируется только пз полностью сфокусированных на объекте лучей, а все другие лучи отсекаются.
Скорость сканирования каждого участка варьирует от 0,25 до 4 с. Увеличение может быть усилено при изменении фокусного расстояния до объекта, при этом исследуемый участок будет или уменьшаться или увеличиваться соответственно. Создаваемое при сканировании изображение (имидж) аккумулируется в точечной форме. Результаты исследования регистрируются в цифровом виде в компьютере„что позволяет проводить математическую обработку получаемых результатов и реконструировать трехмерную форму объекта.
Основными узлами КЛСМ являются: микроскоп, один или несколько лазеров, сканирующая головка и детектор (фотоумножитель). Схема КЛСМ приведена на рис. 5.8*. В некоторых КЛСМ флуоресценция «расщепляется» на несколько каналов и регистрируется через индивидуальный копфокальный микроканал и детектор, что позволяет наряду с использованием соответствующих светопоглоща- ' КПСМ производят в ряде стран Западной Европы (Великобритании, Германии) и США КЛСМ является очень дорогим прибором и в зависимости от предоставляемых возможностей может стоить от 80 тыс.
до 450 тыс. долларов. Кроме того, программное обеспечение, которое продается отдельно, также может стоить от 5 тыс. до 20 тыс. долларов. юших фильтров получать цветное изображение объекта. Для работы с КЛСМ необходимо иметь мощный компьютер с пишущим СР-КОМ и двумя мониторами, где на один выводится изображение исследуемого объекта, а с другого осуществляется управление процессом м икроскопирования и регистрации изображений. 5.1.6. Учет активных (живых) и неактивных(мертвых) клеток бактерий с помощью флуоресцентных красителей Традиционно для тотального учета клеток микроорганизмов как мертвых, так и живых используют флуоресцентные красители — акридин оранжевый, ОАР1 (4,6-г1(аш(по-2-рпепу1(пдо1е), НТС (йиогеасе(п (зогЫосуапаге) и др.
Для выявления и учета только живых, активных клеток бактерий используют РВА (бцогезсе(п ГйасеГаье) и $НЭА (5-зи1(обиогезсе(п йасе1ате). Следовательно„для учета тех и других клеток одновременно в одном образце необходимо готовить два препарата. В настоящее время разработаны комплексы красителей„позволяющие учитывать в одном препарате мертвые и живые клетки одновременно. Были разработаны наборы флуоресцентных красителей, известных под названием 1лче/1)еаг) Вас-комплект (Напя1апд, 1996). Комплект содержит набор красителей (например, Яу1о 9), окрашивающий живые клетки, и иодид прогпгдия (Р1), окрашивающий мертвые клетки. Клетки с неповрежденными мембранами проницаемы лля обоих красителей.
При промывании клеток краситель Буго9 остается в клетках с ненарушенными мембранами и вымывается из клеток с поврежденными мембранами, тогда как Р1 остается в клетках в том числе и с поврежденными мембранами. Оба красителя вносятся в исследуемый образец одновременно, и образец инкубируется в течение 1Π— 15 мин. После этого образец фильтруют через бактериальный (с размером пор 0,2 мкм) поликарбонатный (черный) фильтр и промывают 2 мл изопропанола. Такая промывка усиливает контрастность препарата, живые клетки светятся зеленым светом, мертвые — красным. Клетки учитывают под люминесцентным микроскопом со светофильтрами: 450-490 РТ 510 ЬР 520.
5.2. ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ Морфологические особенности клеток микроорганизмов можно изучать с помощью различных методов микроскопии, а также применяя некоторые спосооы дифференциальной окраски. Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования. Однако су:цествует ряд приемов, которые имеют принципиальное значение и лежат в основе большинства специальных методов исследования морфологии и цитологии бактерий, — способы приготовления препаратов, фиксапии и окраски клеток. Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 — 1,4 мм.
Более толстые стекла не позволяют получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата, так как оно оказывается в тол|це стекла, а это нарушает фокусировку конденсора и резко снижает четкость изображения. Толстые предметные стекла недопустимы при работе с иммерсионным объективом, когда необходимо полностью использовать числовую апертуру системы. Существенным моментом является подготовка поверхности предметных стекол, по особенно важно при изготовлении фиксированных препаратов.
Поверхность стекла должна быть пцательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу, а не собиралась в выпуклые, медленно высыхающие капельки. Наиболее надежный способ обезжиривания— обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. В повседневной работе, однако, вполне достаточно бывает тщательно натереть сухое стекло мылом, после чего вытереть его чистой хлопчатобумажной салфеткой.
Хорошее обезжиривание достигается протиранием вымытых и высушенных стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает). Запрещается кипячение стекол в растворах щелочей, в том числе моющих средствах, а также длтггельное выдерживание стекол в таких растворах, так как щелочи разъедают стекло, делая его поверхность матовой. Хранить чистые обезжиренные стекла можно в сухом состоянии или в этаноле.
Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина по- кровных стекол не должна превышать 0,15 — 0,17 мм. Более толстые стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. 5.2.1. Препараты живых клеток микроорганизмов Для изучения живых клеток микроорганизмов применяют препараты «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток», «агаровая пленка» («микро- культура»). Препараты живых клеток рассматривают с «сухими системами» микроскопа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
