А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 31
Текст из файла (страница 31)
совести исслелуснпя цопугяцн нкрсоргапизмпв; сОогеетс е .- но оца тс бгньшс, чем больше шапнос!ь попуяяции. Лля !!ритце~стени» ш доге разведения с:!сцует обиютельно нсполынии г, новую пносгку. Пренебрежшже энгм правилом присел~о к нпэчсиию ошибочны о резулшэта вследствие еысокои способнее глоток мнкрсоршиизмов к ссрбции нэ !югсрьтюснт сге ла.
Д Песен. Вькспюьс)свснаию можно по р сспшм гл глутятиныь~ спссоб и Перел лосево поесрхнгсощм сгккюбти (рпс. 7 2) разделаю Шзсправлснщю агарыованную птпатс."и ую ср пу п ры стерш!ьных чашек Псзри по 15 — 20 ь а дую. На и ссопгзяют на горизо альппй повсрхитшп, пока ерова ис застынет. Попсрлношь агаризсвэниых сте перел и свом рекомсндупся полсугси ьпля удалгния кпндспсацн ошюб пот ы, пиюримср ю сотне ча к термосшт на 2 3 суг крьацкам ациз. В чашку Пегрн с подсушенной прелой п осэт точно измереняь й обы и (0,05 нли 0,1 л) ссопялс ауюшеш рвэшдснгтя н распрслсг ют его сюклянным тпгатслсь~ о поверызос н ср лы.
Ныссвы па плотнуго ср гу гранов т, э ра юю, из Пжь посас. тшихраэвелений, причем из ыжюшдслыо 2 4 эры кеы. Поясы моткно лсзюь одной пиле «ой, о при этом начинать лсдуе обяипсльно с бсц во!его разведения. Вля шжаого развеле, пспьзуют носын стерилы!ый шназсль. После посеяв чашки Петри ппмеп ают в тер о.
а рышками вниз. Прн иобиннсм посеве танго измор ньш обьем (ык правило, 0,1, 0,5 иви 1,0 ш) исходной суспензии и ра д ра . ну остуженную ло 45 — 50 'С среду, подпиши> перст|сшивают, затем немедленно вьшиэыот в ~яшку Петри и лают среде застыть. В Отучав глубиннопт посс.а оььзуются средой, разлитой прзбирют. При бизе!них ыасштабаь работы среду по пробиркам не разливают, а нос упгю лглуюшнм обрыпм. По 1 мл из соогпе ст уюш ы р висле ия переносят стерильной а пгткап в 2 4 сшрпэьныс ча!акп Петри.
3'нем эю иванн а чашю го 15 -20 ил оралы, распдавле Ой . остужсинои до 45-50 "С., и смс~сишп т п те!юную сред) с пссевныз\ матер алом легким врагцатсльным деииспиеь чшоки по ° оперы, го аш . я юризоыальнай попер нсстгз до эаспяшния среды, коша срази застынет, зшки пе«ри в переверну~оп пкае помешают я тсрмосгат 106 !мл 1 з 1 1 ьп Рнс. 7.2. Схема приготовления рюг«ьчнгзй н посею Юспензгги ьгвкрсорганнэмов шпателем Дл опр дш, ия о ° сс ш ьяегок а аэроб х ыхюрш .зчо чашки Петри после песе а поьв щаня ха»аэрошат Иногдадля опредсле с. оспг аиаэШЖо гшстную среду после шссш остзвхвюг в г рзбирках. Поверхность застыв сй сред за.чинают парафнноьг. Дзя Ючшего учша колоний микрссргагнпмоа среды этом слу гас рекомеввуетсл освюлять. Оггрехслсннс чистшшсоги стгюгих авюрюпв ребуст примененю текннк«Р.Хангейтз Осм.
гл. 3]. 3. Подсчет выроешик колоний. Колони«микрооршннзмов в зав«симо тн от скороши раста подсчнтыгнют через 1 — 15 су югкубании. Подсчет, ю к иышнло, проашшт, неон:рн шч шскП тр .Дл»удсбспа ззуюпш«, у кой на нарюкной стороне дна ашки. Прн бспьшом «оп и гестлс коловий лно чашки Пвгрн лепи на секюры, пропгитнамот колонии в «задом с «пор и сумьгируют гызутюагы. Иногд» длх поле хпа ко!опий яспшюзуют спспнадьные посуаьтонатмческнс счет из к в.
вырастасг от 30 — 50 ло 1ОΠ— 150 колон й. Дслгг число хырссшнк колоний моньше 10, го эти релю тлты лл г рас ею когш сства к!шок в исходном материаве нс непгшьзуюг. Резулшю ы параллельных вь«егюа ю дано! о и тою ис разведении суммируют и опрсзеляап срслнсе п«ло колонкй, выр «ших при вь«есе из разседсни» иа одной чашке.
Количество ыгеюк в 1 мл нсслодусмаго субстрюв гшчиш «ют о форм!не Лу — ' 1О 1' пгс М вЂ” количество «четок в! мл, и — срешюе осло колоний, вмросших после посева ю ванною разведения; 1' — обшм суспензия, взяп,ю ллл оосееа, мл; ДР— ксэффкпнснт разведения. 107 7.2.2. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений) Тэб тица 7.1 Наябмме верогписс «еэнчеспю кэего «р р и суслеэзлн (во Маэ-Креда) ели эпе еб е а с панов На м. Р э- рчс жэ е асег эо г гое ожэ числе 2 ~ 3 4 433 ' -1- ЗО,О 5 ООО О,О, О,О 0.2 0,2 0,5 0,4 0,0 О,О 0,3 110,0! 3,5 — 4,0 2,0 1,4 001 002 0.5 223 434 35,0 1,2 440 230 3,0 25,0 3,5 1,7 231 003 40,0 ! 4,0 70.0 1,4 441 3,5 4,0 2,0 010 0,5 0,3 0,2 0,2 232 011 09 ОД 0,5 0,4 140,0 2,0 З,О 1,4 444 012 0,7 О,б 1ОО,О 4,0 241 0,6 450 ! 0,9 5,0 4,0 ' 1,6 О,б,' 0.5 0,5 1 0,7 О,б 301 1,! 451 302 1,4 500 2,5 106 Метод исгголыукт Лля подсчета микроормнизыоа, которые плохо или совсем не расгут на плотных питательных средах.
В пробирки с жилкой средой вносят строго измеренный объем нз ра.ыичпых развелений питательного сзбстрата. После инкубаппи, исходя из числа оробнрок, в которых наблюлалсн нли отсугствоваз рост, рассчитываатг нанболса жроятнсе число клеток. сопелям щихсгг ь 1 мл исследуемого субстрата. Таким образом „определение количесгва мпкрюрганизмов методов! предельных разведении включает приготовление разведений. посев в эидкую среду, регист!жцию наличия гми гпсугсгвия роста после инкубациа и расчет наиболес вероятного часла клеток в елинипе объема исходного субстрата. 1.
Прнпгтовлеиле разведений. Разведения исходной суспензии готовят кэк и лчя чашечного ьгетода. 2. Посев н регистраннл результатов. Стерильную среду ореюмрительно разлимлот в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проеодлт из кажлого разведения или из 4 — 5 иослелних, причем каждое разведение высевавж в 3 — 5 поюорносгг1х (ларачлельных пробирках). Количество посевного мазериала веже олинаково и, кэк правило, составляет! мл.
Засслнные пгюбирки помещают в термастат. Время иялубации кслеблегся от 2 ло 15 суг и зависит ог скооктьг роста микроорганизмов, численпосп !готорна определяют. После инкубации регистрируют рост микргюргаиизмов, испольмп былинные покэзатели: помутнение среды, сбразоганае пленки, осадка, газа нли накопление в среде определенных пролуктов метаболизма.
Н бол вли и «! !ни и!* и"1 Нвс более ар» ин ло иикг юрсл р э. е перл ы рсб роке иоле »е саки" рлк ю 2 3 3 4 022 ЗОЗ 2,5 4,5 , '1,6 ! 1,1 0,9 501 О,З 07 Об 310 ОЗО 4,0 7,5 2,0 1,4 031 09 - 311 6,0 503 !15! 3 О! ! 7 040 0,9 - 312 504 313 !6,5 ! 3,5 ! 7,0 510 3,5 4,5 320 0,6 ! 0,4 9,5 , '2,0 , '1,4 15,0 ! З,О ' 1,7 511 101 1,2 ! 0,7 0,5 0,4 32 ! 512 6,0 102 0,8 О,б 322 20,0, 3,5 ! 2,0 513 8.5 103 1,0 028 323 520 30,0 ! 5,0 1,3 )07 0,5 0,4 330 110 25,0 З,О! 1,7 521 7,0 45,0 ! 3,5 ! 2,0 2 О 1,! 522 9,5 523 12,0 1,3 — 333 ! 140,0 113 5,0; 524 !5„0 !20 2,0 3,5 , '2,0 4,5 ! 2,5 0,8 0,6 340 1,1 О,В 341 525 17,5 121 3,0 1,5 530 8,0 2,5 122 1,3 1,0 350 531 11,0 532 123 1,6 400 1,1 1,8 401 2,5 1,3 14,0 1,6 !30 3,5 533 17,5 534 131 1,4 1,0 402 5,0 25,0 132 1,6 — 403 7,0 2,5 535 410 3,5 1,7 540 13,0 411 5,5 2,0 541 17,0 0,6 ! 0,5 412 2,5 0,9 8,2 2,5 542 20! 5,0 0,9 ! 0.7 4 13 8,0 ЗО,О 202 2,0 1,2, '0,9 414 1,6! 1,2 420 35,0 203 6,0 2,0 545 45,0 0,9 ! 0,7 47 1 1,31 0,9 422 6,5 2,5 550 25,0 17,0 55! 35,0 1,6, '1,2 423 2,0 3,0 13,0 3,0 552 60,0 213 424 20.0 90,0 220 2,0 25,0 1,3.
'09 430 11,5 1,5 16,5 З,О 100,0 221 70.0 3,0 1,6 ! 1,2 431 555 180,0 432 20,0 4,0 109 Чи к р е- ристивв 041 ИЮ 1!1 !12 140 14! 210 211 6,0 13,0 1,5 2,0 ! 23 О,З 0,2 0,8 0,8 1,1 О В Чв лор' рс~слккв 311 332 11О,О 40,' 1,7 2,0 543 544 553 554 Окоиоааие кобе. 7. ! Наиболее веролгное чисчо мнкрооргаюгзмов в единице сбьемз рассчитывают по 'шблице Мак-Крепи (табл. 7.1). рззрабгланной на основании метолов вариационной статистики. Лля зтого первоначально сосшвляют числовую харак гсрнстнку, которая включает три цифры.
Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, прн вьгсеае из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. )(ве следующие цифры обозначзвп число пробирок, в которык охмечен рост микрюргвнизмов при выееве из лв>ъ гтосзщчогц>кт рювсдсний. Затем по таблице находят наиболес ве!юятное число микроорганизмов, сгютвстствующее данном> значению числовой карзкгеристнки.
Количесгло микроорганизмов а 1 мв (! г) исходною субстрата соответствует атому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики. Приведем примеры. Пример ! Пример 2 7.2.3. Общие замечания Точ>госп, любого метода определения числа микроорганизмов ограничена ошибкой метода, которая возникзет всхсдсцгие случайного распределения клеток в суспензия и является результатом о>раничегггюго числа подсчитыааемых клеток, а также связана с техническими ошибками, т.е.
неточностью в приготовлении разпелений. неправильным монтажом камеры, повн>рньш учетом одной и той же ю~стки (колонии) и т ч Ошибки мет ° да неизбежны, тогда как тсхяпчсские ошибки зависят главным образом пг кшеств» работы исследователя. Сзааует помнить, по сгатишяческая обработка резулшатоп возможна только при мииньашьной технической ошибке. Чашечный метол и метол предельных рашедений требуют особой шстаты и акк>ратности при выполне- 110 нии всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки, пробирки и среды от заражения микроорганизмами из воздуха, так как каждая случайно попавшая клетка может заметно завысить число микроорганизмов в исследуемом субстрате. 7.3.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВЗВЕШИВАНИЕМ Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток„выращенных на плотной питательной среде, однако в этом случае микроорганизмы необходимо предварительно тщательно смыть с поверхности среды физиологическим раствором или водой и перевести в суспензию. Метод не может быть использован при культивировании микроорганизмов на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.
Определение биомассы состоит из трех последовательных операций: доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения; отделение клеток микроорганизмов от культуральной жидкости; определение их массы. Чаше всего определяют массу сухих клеток, хотя иногда можно ограничиться определением сырой биомассы.
В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить пустую центрифужную пробирку (фильтр), но не доводить ес массу до постоянного значения. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр кульгуральной жидкости. 1. Доведение массы цептрифужиых пробирок или фильтров до постоянного значения. С этой целью фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри или центрифужные пробирки (не пластиковые!), помешают в сушильный шкаф и высушивают в течение ! — 2 ч при температуре 80 — 85 'С или 90 — 100 С соответственно. Затем чашку Петри с фильтрами или центрифузкпые пробирки вынимают из сушильного шкафа и оыстро переносят в зксикатор с безводным хлористым кальцием (СаС1,) илц концентрированной серной кислотой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
