А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Продолжительность культивировании 3 —. 5 суг. Образоыние аммиак» обнаруживают по изменению цгпга лакмусовой бумапг, а также качсстаенной реакцией с реактивом Несслера. Испопьзов»ние »зотвминервпьиыл солей Спсссбнасть милроорганиэыов испольювать соли аммони» или нитраты в качестве источника азот» проверяют на си!гпепгческнх средах. Оживят два »арианы среды.
Состав основной спелы (г/л); глюкоза — 20,0; КтНГОл — 1,0; КНтРО, — 1,0; МВБО,. 7НтΠ— 05; Набй — 05; анар — ! 50; раствор микроэлементов (слг 5.2.1) — 1 ыл; РН 7,1 — 7,2. Б первом варианте к основной среде лсбюшлют НН,С) — 1,0 и СаСО» — 5,0, гвк как хлористый аммоний — физио логически кислая соль, во втором вариаь'ш КНОэ — 1,О. Среды разливают в 122 пробирки, ашрилизуют при 0,5 атн и после стернлнзацип скашивакн. Посев провогагг штрихом, пролоижитсльнссп культивирования 2 — 1О суг.
Росс гши егп отсутствие стмсчшот визуально. Способность усваивать аммонийныс соли или ннтраты можно проверить и на жидких срслах тато жс состава. В атом случае по окончании опыта имесосбразно )становить ггслнагу использования данной соли. С этой пелью в куэгьтуральной жипкаств опуелеляюг присутствие иояов аммония или нитратов качественными реакциями. Для ко!!тралл проводят реакнии с сшлветствующей стерильной средой.
8.2.3. Использование молекулярного азота О с! вжобнссти аэробных мнхроорганизыов использовать молекулярный азот можно судить по иь расту на йзсэо~лисглсб среде Эмба, которая имеет слсяующий состав (г/л)г маннит — 20,0; КзН!'΄— 0,2; МКВОч 7НтО 0,2; НаС) 0,2; К!50! — 0,1; СаСОз — 5,0; агар . 200; рН 7,1-.
7,3. Степу рамивангг в грсбирки, егерилизуют при 0,5 ати и готовят скошенный агар. 1!осев проводят ° прахом. Прокол'кнтельносгь культивирования 7- 10 сут. Нсабхолкмо атмеппь, гго на срме Эшби ыогут расти нс только микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот, но и алигонитрофгщы, т.е. микрсоршнизтгы, споаобные усваивать ничтожные количества связанного азопг, сол«ржащегося в реакп пах, воле н павлухе. Обильный рост на среле Эшби может свилетельствояап о приналлсжности бактерив к ататфиксаторам. Мшекулар нназотлюгугфакснровэтьиэнээроб вебактернн Д,аэыя!с!енняшой споссбнсати у прелстэвнтслей рода Оси и!иг нсполыугат ср лу слелун шага состава ~гул): лрахсхсвай эксгргш — 0,015; гл!сказа — 20,0; КхНРО, — 1.0г Мазо, 7НзΠ— 0,5; 'Чгрл — 0,5; Мпуо и Резо, — л лы !по ! ьш 1%)гс раствора кажной сс а), СэСОэ— 20,0; РН 7,0.
Среду разлиепот в высокие пробирки и смрплнзуют нра 0,5 атн. После стерилнзэаив и!юбврк» ла. ншю почт во пробки сгеричь он средою в рогргвис1 нэ хнаяшей валяной бане течение 20 30 мин лла увале нэ распаренною в свело ююлорола зэпн среду в пробнрюп быстро охлвжааю пол с руев хааоанай зояы в прэмгвит посев суспензней микроарганязмо». Посевной ашер .
г а гегхай на з а пробирки. Пров лжн т ~есть культнвнрзваннл — 2 — 7 су!. Но а о иванн опыта глме вют рссг азогфнксаюров — па угнан ю срезы, образованна газа, оаалсн е.в- паха насляион к шогт !призна!с, характерныа ю» азогфыкснру~огхггх ктссгрнм й) нгш его отсутствие. 8.2.4. Отношение к молекулярному кислороду и рост в знззробных условиях По отношениго к мслекуялрнаму кнслорсву среяи мнкраортанизьюв вылслякч группы сбхаеавшмх аэрабиг и лщгаюяэрофилв, бакульс а тиювх, азрсмсэерилмных и плрсгих алазробсе.
Чтобы сулить о лринмзежноши микргюршннзмов к тогт или иной группе. микробную суспензию выссвают в пробирки с расплавленной и сстуленнпй Ло 40--45 'С ашризоганнай пнтшельной средой. Пасси чожва щюволгпь н уколом. Строгие аэрсбы растут на повсрхнссп! срслы и в верхнем слое, микроаэрофилы — на неюзтором расстоянии от поверкносги. 123 2 У у Рис. 8.!О. Рост микрогрггжизиов при посеве уколом (а) и при осела расллаэленную плотную срезе (др à — -в б .
т в л ! л,з — Ез у иювабьк З вЂ” ввэр б, факулюатиэиые анаэробы обычно развплаьэтсл по всей толше среды. Строгие а~ ~аэробьг растут только в глубине среды, у самого диа пробирки (рис. 8.10). флкулыативиые виаэробы хорошо растут и в аэробиых, и в внаэрсбиых условиях. В аиаэробных услоэиах мпопге из них способны лспользов:пь в квчеспге конечного акцептора электронов ие кислород, а нитраты. Н ходе згого процесса, пазьпаемого нитрагиым дыханием, нитраты вссстанагшиваюгсл до нитритов, и далее до Н,О и газообразного азота. В случае образовании этих газгюбрачиых продуктов говорят о денитрификацив.
Другие факультативиью анаэробы могут в аиаэрсбиых условиях переключатьсл с дыхания на брожение, и тогда в средах с углеводами накапливакпсл значительные количества органических «полог и друпж пролуктовмегаболизма. Определение способности к азробному дыханию Тест иа пылание (поглощение молекулярного кислорода) проводит с пс пользованием пгжяроцеф» и платииохлорсеребрлното электролд закрьгтопв типа, позволявшего регистрировать дыхание в небольших по обьему образцах (см. гл. 3). Длл измерения скорости дыхании клетки аэрзбпых микроорганизмов, вырашевиые иа соогвегствуюшил средах, собирают пеитрифугг~роввит1ем (режим зависит гл размеров клеток), промывают физиологическим пли буфериым раствором с оптиыальным для даииого обьекш РН и суспеидируют в небольшом обьемс буфера из раечюэ примерно 3 ьгл иа ! г осадка вырыл клеток. Клсткп в течение эхсперимепта храпят на лыу.
В лчейку полярографа внссш клетки (обычно 0.1 обьема ячейки) и дсбавллют проаэрироваиный буфер той же темперюуры. Репгстрапвю поглашеиив кислорода следует проволить в термостатироваиных эч виках при теьшературе, близкой к температуре выращивания испытуемою ьгикрсюрганизма. Регистрируют поглощение О, пробои без субстрата (эидогеиисе дыхалке), затем пшрицем добавллгж соответ- 124 ствующий субстрат (обычно 10 ~ — 10 з М).
Регистрацию ведут в течение нескольких минут, причем в первый период времени после добавления субстрата дыхание должно быть линейным, т.е. его скорость не должна изменяться со временем. Если такой линейности не наблюдается, то можно попытаться снизить концентрацию клеток или увеличить скорость движения ленты самописца. В качестве теста на функционирование терминальных оксидаз можно добавить в ячейку с клетками ингибиторы, цианид или азид (Внимание! Сильнейиие яды! ). Их добавляют до конечной концентрации 10 — 10 ' М, в таких условиях клетки теряют способность поглощать кислород. Расчет скорости дыхания проводят по ленте самописца, учитывая скорость поглощения клетками кислорода в первые 1 — 3 мин после добавления субстрата; рассчитывают также степень подавления дыхания (%) при той или иной действующей концентрации ингибитора. Данные рассчитывают на 1 мг общего клеточного белка (см.
гл. 12). Для калибровки шкалы полярографа измеряют содержание кислорода в насьпценной воздухом дистиллированной воде (100% кислорода) и в той же пробе после добавления 10 М дитионита натрия (О % кислорода). — 2 Способность к денитрификации Это свойство определяют на среде следующего состава (г/л): глицерин— 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0; ()чН4)зБ΄— 2,0; КХОз — ! 0,0; К,НРО4 — 2,0; Мя504. 7НзΠ— 0,025; 1ЧаС1 — 0,5; Ре504 7НзΠ— 0„001; агар — 1,0. Среду разливают в пробирки по 5 и 10 мл и стерилизуют при 0,5 ати. Исследуемый микроорганизм вначале засевают в пробирки с 5 мл среды (1-й пассаж). Посев делают уколом.
Через 24 ч петлю культуры 1-го пассажа переносят в пробирки с 10 мл среды, которую предварительно расплавляют и охлаждают до 40— 45 'С. После внесения микроорганизмов среду перемешивают, остужают и заливают 2 — 3 мл стерильного 1%-го водного агара для создания анаэробных условий.
Рост бактерий, способных к денитрификации„сопровождается помутнением среды и выделением газа. Проверить способность бактерий к восстановлению нитратов можно и на МПБ, к которому добавляют 0,2%-й раствор К(ЧОз. Среду разливают в пробирки по 10 мл„опускают на дно каждой поплавок и стерилизуют при 1,0 ати.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
