А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Посев проводят суспензией клеток. Продолжительность культивирования— ' — 5 сут. По окончании опыта отмечают накопление в поплавке газа Щ) и определяют качественными реакциями присутствие в культуралъной жидкости нитратов и нитритов. Реакция иа иитраты с дифеииламивом. На фарфоровую пластинку наносят каплю : опцептрированной серной кислоты, помещают в нее несколько кристаллов дифени.-.амина и после его растворения добавляют каплю исследуемой жидкости. При наличии ионов 1ЧО, жидкость окрашивается в темно-синий цвет.
Следует иметь в виду, что ззотистая кислота также дает с дифениламипом синее окрашивание, поэтому пробу ла иитраты можно проводить только при отсутствии в среде нитритов. Крахмал-йодяая реакция иа иитриты основана на том, что нитриты в кислой среде зкисллют йодистый цинк с выделением йода, присутствие которого обнаруживают с 125 крахиююм Для провелс пгл реа цци к калле г.улыуральной гкиакссп! лобаююс капюо распюра, солержашсш 2пц!», К! и крахмал (пришгоюение реактива еи. в ариложении 5), н каплю ржтаора НС1.
Прв наличии в срсл ннтрнюв лояеллетсл свисс оьрашимише. Рюкаая и» р им с ревкомом Грасса свившие !!а образовании в «калаи сроке в прнсутюы!и ннтр то и ароиюнческах аип ов (сульфофенозсвой югслогм я а-нафтилаь!ила) атесоеянненш, окрашенного в красно.розовьф цветюб!л про!аления ре аюг:к к капле реактива Гр сса (прнштвленне реакпгаа ем. в приложении 5) лаба я юг канаю культуры!ьной юглкссти. Полвлснис красного окрашиышня евгщетельсп уев о ирисугст нн нитрнвза.
Парюше.гыго провалят р акции со емрильиой срелой. Определение способности к брожению Способность к броженшо обычно опрецехлют при исполцюва! гни углсволно-пегпонной срелы с шносительпо вмсокои конпентраштсй углеводов и небольшим количеством пе!попа. Сост!в срелы (г/л): углсвоц — 10,0; пыпон— 2,0; 1ЧаС! — 5,0; КтНРОа — О,З; агар — З,О. 1!а 100 мл орели цсбавлягот О,З ьы )%-т волного рвотно!ж броьпимолоаого синего, рН срецы 7,1 7,2.
Суслу без уптеваца стерплизуют при 1,0 ати. Углснолы (глюкозу, сктарпчу, лакгозу) лобавллют к сгерюп ной расплавленной срсцс в виве 20" 40%-х растворов в листиллированной г Пе, которые стерилизуют при 0,5 ати. Стерильную среду с углеаоцами ращивюог в стерильныс пробирки слоем в 5 — 6 см и после того, как ореха вас ! ынет, се засеюют исслевуемым микроорганизмом. Посев легюст уколом. Зрш кажвого ум скока используют лве пробирки.
После посева поверхность среди в овцой пробирке мливакт стерильным расплавленным !!ггрифином или смесью маслинового шюла и парафина (1: 1) яли водным атаров! (1,5 ! вира на !ОО мл) слоем 1 — 2 см. Прополз'втгльпость культивирования от 2 ло 7 сут. По оггончании опыта релкарируюг изменение рН среды по перемене цвета индикатора. Аэробгтыс иикроорпанизмы, рсущесгвллющие пихание и нс способные к брожению, растут нв поверхности орели амелько в пробирке без парафина и образукп небольшое количество юклот лишь в верхнем слое срецы.
В случае нейтрализации эти» кислот продуктами разложения пептона а поверхностном слое орели набшоцаешя щелочная реакция. Микрооргвнизмь!, способные сбраживать углеволы, растут и образуют кислоты в обеих пробирках, но кислотность в аназробных условилх значитегшно выше, чем в псрвоь! авриюпе Ото хорошо звмстяо по изменению цвепг инцикатопв Если брожение сопровождается сбразоввгпгсм юзов, то происхоцгп разрыв агаризованной среьм. 8.2.б.
Определение внеклеточнык ферментов Как указышлось вьлпе, некоюгрые иикрооргвнизь!ы способны использо° ать в ка гестас пщательных субст!етов самые !жзаичные высокомолекулярные совцинсния: полисахарилм, Силки, нуклеинавыс кислоты, лнпилы н лр. Однако макромолекулы не мог)т проникать через мембрану каетки. Они поцвергаются расщсгшению, которое осуществляется поц возцеиствием экзофсрментов, спюсящихся к к!ассу гилролаз. Гзсаьшинспго нз них югталпзирует пщро- 126 лиз полимера до растворимых продуктов, обычно димеров или мономеров, которые поступают в клетку с помощью специфических транспортных механизмов. Образование экзоферментов широко распространено среди различных групп микроорганизмов.
При поиске продуцентов ферментов гидролаз в лабораторной практике применяют специальные методы. Сущность их состоит в следующем. Микроорганизмы выращивают на агаризованпой среде, содержащей макромолекулярный субстрат. Если клетки выделяют в среду экзоферменты, гидролизуюшие данное соединение, то выросшие колонии будут окружены зоной, в которой обнаруживаются продукты гидролиза. Амилолитическая активность Крахмал подвергается гидролитическому расщеплению под действием амилаз, активными продуцентами которых являются различные виды бацилл, псевдомонад, стрептомицетов и мицелиальных грибов. Для выявления амилолитической активности часто используют среду следующего состава (г/л): пептон— 10,0; КН,РО, — 5,0; растворимый крахмал — 2,0; агар — 15,0; рН среды б,8— 7,0.
Среду стерилизуют при 1,0 ати и разливают в стерильные чашки Петри. Когда среда застынет, исследуемые микроорганизмы высевают штрихом по диаметру чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2 — 10 сут. Гидрплиз крахмала обнаруживают после обработки атаровой пластинки раствором Люголя (см. приложение 5). Для этого на поверхность среды наливают 3 — 5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измеряют в миллиметрах от края штриха (колонии) до границы светлой зоны.
Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше амилолитическая активность (рис. ЗЛ1). Рис. 8.11. Определение амилолитической активности: а — схема посева (1 — 4 — штрихи разных культур); б — среда с культурами после обработки раствором Люголн 127 Протвопитичвсквя активность Протеолитическпе ферменты (протеазы) катю!изирухтг расщепление белков на воли- и оангопепгицы. Прстеазы выделяются различными виламп бацьшл, актиномицетов, мицюгнальвых грибов и другиьпг микроорганизмами Лктшшость гшеклсточнык протеаз определякп, используя в ьлчеспге субстрата жглатину, казвин нли другие беяки. П)ютеалш желатииы.
Милрооршнияхы высеваюг на ьшсопыпонную желал н ну (МПВО. Ее готовят слелуюшпм образом. К 100 хш МПБ лсбаюшют !Π— 15 ! жслатины, оставляют на 20 — 30 мин, пабы она набуюга, затем смесь нагревают на водяной бане ло полного раст вгч они» желатины и разливают полученную МПЖ в пробирки по В 10 мл. Стерилизуют 15 мин при 0,5 аги. Посев !гровшштуколоьг, Прололхопсльносп,кулыинирования 7 !Осу! при комнат ной температуре. Раюкпженяе желатины отмечахтг визуально.
Если жслюина Разлчакаштя, уьлзывагот интенсивность и аюдагу рквюошння — послойное, воронкообразное, мсшковилнсе, пузьгревиднсе и т д. (рис. 8.12). Протеелиз казвина. гбиг яылшенгггг мой способности испалкзукп молочный агар — среду. сошоашую из равных частей стерильного обезжиренного молока н стерильною 3(С!о водного асара. Как правнчо, перел прггготоыенггеьг среды молоко обсзжпрявагот центрифупгрованием в течение 15 мин при 650..
1500 я. Жиры, которые образуют на поверхности мгшокв достаточно плотную пленку, удаляют, а молоко стерилизуют прп 0,5 атп. После стерилизации его подогресегст и лобавллкл при !тостоянном помепгивании к стерильному расплавленному и остуженному до 50 С водному шару Полученную среду разливают в стерильные чашки Петри. Микроорганизмы высею ют штрихом по диаметру чашки нли уколом.
Продолшпелы!ость культивирования 2 — 10 сут. Гидролиз казвина сбнарул;пвают по зоне просветления среды вокруг колонии или выросших по нприху микроорганизмов. Особенно четко она видна посл«обработки среди 551-лг раствором трикларуксуе! !ой кислоты. Зону пгярол ила казси. на изьгеряют е миллиметрах с г кран шгрнш или колонии до границы свепюй зояы.
Чехг бцчьгпе диаметр сштлой зоны, тем выше казеинолитнческал активяосгь бактерий. Рнс й ! 2. Схема раз хяження желатхны мнхроор!апг!зхгами пря пссаве ухололс -хнг Р шке;6 — ! сы г — ьеяояхе гх*м, — ямю «,д . Х 120 Липолитическая активность Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. Продуценты липаз обнаружены среди дрожжей, мицелиальных грибов, бактерий рода С1шГг1йиш и прутик микроорганизмов. Для выявления липолитической активности исследуемые микроорганизмы высевают на среду, содержащую соответствующий липид. Определенная трудность при постановке таких опытов связана с тем, что жиры не смешиваются с водой. Поэтому чаще всего вместо жиров в среду вводят твины — эфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-б0 — стеариновую, а твин-80 — олеиповую кислоты.
Твины хорошо растворимы в воде и имеют нейтралы|ую реакцию. Состав среды (г/л): твин — 10,0; пептон — 10,0; ХаС1 — 5,0; СаС12. Н10 — 0,1; агар — 20,0; рН среды 7,4. Готовят среду без таина и стерилизуют ее при 1,0 ати. Водный раствор таина соответствующей концентрации сгерилизуют отдельно при 0,5 ати и добавляют к стерильной основной среде. Среду разливают в стерилып те чашки Петри. Когда агар застынет, на поверхность атаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживакп при соответствующей температуре необходимое лля роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из таина.
8.2.6. Образование антибиотиков В процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы образуют специфические продукты, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к другим микроорганизмам или вирусам, задерживая их рост или убивая их. Они называются антибиотиками. В отличие от общебиологических ядов антибиотики проявляют свое действие лишь по отношению к отдельным, вполне определенным видам или группам микроорганизмов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
