А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Однако если в результате эволюционной дивергенции последовательности нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК вЂ” ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению. В таком случае гибридизация ДНК вЂ” рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосомные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы.
В итоге методом ДНК вЂ” рРНК-гибридизации часто обнаруживая>т довольно высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциацил ДНК— ДНК не выявляет заметной гомологии. Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зоидов (гевиых зондов) — разновидность метода молекулярной гибридизации ДНК вЂ” ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии.
Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для эттпо вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затвм отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК лигируют в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Е~сЬег1сйп сой).
Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК-зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом авторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бак~ерин делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. Для идентнфикации бактерий и создания филогенетической системы их классификации наиболее широкое распространение и значение получил метод анализа нуклеотидиых последовательностей в рибосомальиых РНК.
Молекулы 55, 165 и 235 рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности. Считают, что они находятся вне механизма действия естествен~ юго отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. Накопление мутаций зависит только от времени, поэтому информация о нуклеопшной последовательности этих молекул считается наиболее объективной для определения филогенетического родства организмов на уровне от подвида до царства. В случае анализа 58 рРНК обычно определяют полную последовательность нуклеотидов, которая в этой молекуле у прокариот составляет! 20 нуклеотидов.
При исследовании 165 и 235 рРНК, 139 содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеотилов, полученных из этих молекул с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции. Наиболее широкое распространение получило изучение последовательности нуклеотииов в 168 рРНК. Изучение структуры 168 рРНК представителей разных микроорганизмов привело к выявлению среди прокариот группы архей. Значения коэффициента схолсгва Яда, отлеляющие 168 рРНК бактерий и архей, лежат в прелелах 0,1, в то время как значение Ь;,а, равное 1,0, соответствует полной гомологии нуклеотидных последовательностей, а 0,02 — уровню случайного совпадения.
Все чаще лля гшентификации бактерий предлагают деидрограммы, показывающие взаимоотношения межлу бактериальными родами, вилами или штаммами на основании изучения последовательности нуклеотнлов (или олигонуклеотидов) в рРНК, а также ДНК вЂ” ДНК и ДНК вЂ” рРНК гибридизации. Однако идентификация бактерий до родов на основании только генетических методов без предварительного изучения их Фенотипических характеристик часто вообще невозможна. Поэтому лучшим подходом в работе по систематике бактерий считается изучение как генотипических, так и Фенотипических свойств.
В случае несоответствия между филогенетическими и фенотипическими данными приоритет временно отдают последним. Особой проблемой является идентификация таких бактерий и архей, особенно морских видов, которые не способны расти на известных лабораторных питательных средах и для которых поэтому нельзя было получить чистую культуру. До недавнего времени эта проблема казалась неразрешимой. Однако около 15 лет назад были разработаны методы, позволившие экстрагировать, клонировать, секвенировать и сравнивать рибосомные РНК прямо из окружающей среды. Это позволило точно сосчитать и идентифицировать микроорганизмы, населяющие данный биотоп без их выделения в чистую культуру.
Идентифицированный таким образом «некультивируемый» в лаборатории микроорганизм может быть даже описан, но с присоединением слова «сапдЫа1пз» (кандидат). Слово «сапе)к)агфа» будет сопровождать новый вид до тех пор, пока учеными не будут найдены условия культивирования этого организма в лаборатории и не будет получена его чистая культура, что позволит изучить все его свойства и опубликовать в качестве узаконненого.
Идентификацию бактерий проводят обычно с помощью «Определителя бактерий Берджи» (Вегбеу'з Мапца1 оГ Пегепп)пагьуе Васгепо!ойу), Первое издание этого пособия было осуществлено в 1923 г. под руководством известного американского бактериолога, Д. Берджи (П.Н. Вег8еу, 1860 — 1937). С тех пор оно регулярно переиздается с участием ведущих ученых-микробиологов мира. В последнем, 9-м издании определителя (1994) все бактерии разделены на 35 групп по легко определяемым фенотипическим признакам.
Эти признаки вынесены в названии групп. Таксономическое положение бактерий внутри групп определяется с помощью таблиц и ключей, составленных на основе небольшого числа фенотипических признаков. Дифференцировочные таблицы для дифференциации видов бактерий некоторых родов, например рода Васй7дг, не приводятся, а читатель отсылается к «Руководству Берджи по систематике бактерий». В 4-томном «Руководстве Берджи по систематике бактерий» (Вег8еу'з Мапца1 оГ Буагетабс Васгег!о1о8у, 1984 — 1989) содержится более полная информация о таксономическом положении бактерий.
Для каждой группы бактерий дается описание входящих в него родов и видов, в том числе с неясным таксономическим статусом. Помимо подробного фенотипического описания, включающего морфологию, организацию и химический состав клеток, антигенные 140 Ключ для определения бактерий рода Вас!!!иг 1.
Каталаза — есть ........,............................... 2 — нет ....................................... 17 2. Реаюайя когес-Проскауэра — положительная ..................... 3 — отрицательная ..................... 10 3. Рост в анаэробном агаре — есть .............,................„......... 4 — нет ......................................... 9 4. ост при 50 С вЂ” есть ...'..................................... ..Р 0 — нет ......................................... 6- 5. Рост в МПБ с 7 % ХаС1 ' — есть В. 7иЬет~огти — нет, В.
соари1аае 6. Кислота и газ на среде с глюкозбй — есть В. ро!утуха — нет ......................................... 7 — есть .......,................................ 8 — нет В. а!ге1 8. ТГараспоральные тельца в спорангии — есть В. 1аи)ппрревей' — нет В. сегеие Ъ.Тидролйз крахмала — '' "есть В: ейЫБ ' — нет В. оит!!ие 10: 'Рост 'прй 65 С' = ' " "' — есть В хгеаго1аеггпорИие — нет .............,.......................,.
1 1 7. Восстановление ХО, до МО~ П; Гйдролиз крахмала ' — "есть ............................'.......... 12 — нет ....................................... 15 12. Кислота и газ"йасреде с ппокозой — "есть З. тасегаае — нет ...................'.................... 13 ГХ ПГйрина 'клеток 10 мкмггбблее = — дй " -В: л~е~а1епит'=" ' — нет ....................................... 14 14. рН среды для образовайия ацетойна менее 6,0 — да В.
с1гси1аае — нет В. /)гтие 15. Рост в айаэробном агаре ' ' — есть ' В. Та~егоерогй1 — нет ....................................... 16. Кислота на среде с глюкозой — есть В. багет!л — нет В. ерЬаег1сие 17. Рост при 65 'С вЂ” есть В. креагп)ЕегторГнТт = — нет ....................................... 18 141 свойства, вил колоний, особенности жизненного цикла и экологии, в характеристике родов пргшодятся также сведения о содержании ГЦ в ДНК, результатах гибридизации ДНК вЂ” ДНК и ДНК вЂ” рРНК. Ключи и таблицы позволяют идентифицировать бактерии не только до рода, но и до вида. В настоящее время выходит в свет второе издание 4-томного «Руководства Бсрджи по систематике бактерий» !Вег8еу'з Мапва1 о1 8ув1егпа11с Васгепо1о8у).
В 2002 г. вышел первый том. Кроме этого имеется ряд статей и книг, в которых предлагаются оригинальные ключи для идентификации отдельных групп бактерий, например бацилл, псевломонад, актиномицсгов, энтеробактерий. Для иллюстрации приведем схему идентификации некоторых видов бацилл. 18.
Гидролиз казсина 19. Параспоральные тельца — есть В. 1аггае — нет .................................. — есть В. рор11йае — нет В. 1ел115погЬиз 19 Таблипа 9.1 Минимальный перечень данных, необходимых для описания новых штаммов бактерий (по Н.Тгпрег, К.йсЫе)уег, 1992) Дополнительные признаки Свойства Основные прпзнакн Форма; размер; подвижность; внут- ри- н внеклеточные структуры; вза- имное расположение клеток; кле- точная днфференпнровка; тип кле- точного деления; ультраструктура клетки Цвет; характер жгутнковання; споры; капсулы; чехлы; выросты; жизненный цикл; гетеропнсты; гормогонни; ультраструктура жгутиков, оболочки, ю5сточной стенки Морфология клеток Особенности ростана плотных н в Цвет колоний, суспензни жидких питательных средах; морфо- ЛОГИЯ КОЛОННй Характер роста Окраска По Грвму На кнслотоустойчивость; окраска спор, жгутиков Состав ДНК; запасные вещества Гомологня нуклеиновых кислот; клеточные пигменты; состав кле- точной стенки; типичные ферменты Состав клетки Физиология Потребность в солях нлн осмотн- ческих факторах; потребность в факторах роста; типичные продук- ты метаболизма (кислоты, пигмен- ты, антибиотики, токсины); устойчивость к антибиотикам Отношение к температуре; к рН среды; тип метаболизма (фототроф, хемотроф, лнтотроф, органотроф); отношение к молекулярному кислороду; акпепторы электронов; исгочникн углерода; источники азота; источники серы Патогенность; круг хозяев; обра- зование антнгенов; серологня; восприимчивость к фатам; симбиоз Экология Условия Обитания 142 Полные дифференциальные характеристики этих видов бактерий рода Васйиз по нескольким десяткам признаков приводятся в Вегйеу'з Маппа1 оГ 8уз1егпабс Вас1епо1ойу, 1984 — 1989.
В настояшее время накопилось много новых данных, в том числе полученных в результате анализа нуклеотидных последовательностей рибосомалыгых РНК, об изученных ранее и вновь выделенных видах бактерий. На основании этих сведений видовой состав некоторых групп бактерий, например рода Вас((Ы, будет пересмотрен: часть видов останется в составе рода Вас(1(пх, а некоторые образуют новые роды или будут отнесены к другим, уже существующим родам бактерий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
