А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 42
Текст из файла (страница 42)
В другом, более точном методе, где используется Тас)Мап 5'-нуклеаза, имеет место определение накопления ПЦР-продукта в течение реакции амплификации по изменению свечения флуоресцирующей пробы. При этом происходит накопление флуоресцирующего продукта, что приводит к усилению флуоресценции, которая пропорциональна накоплению ПЦР-продукта. В этом методе фактически контролируется количество циклов, а не количество ПЦР- продукта после фиксированного количества циклов. Этот метод и его некоторые модификации получили название Кеа1-Типе РСК, 10.1. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ДНК Первый этап при идентификации микроорганизмов молекулярно-биологическими методами — разрушение клеток и выделение НК. Известно множество методов, позволяющих разрузпать бактериальные клетки как чистых культур„так и микробных сообществ в образцах естественных субстратов. В целом следует отметить, что для разрушения клеток чистых культур чаще используют комбинацию детергентов и литических ферментов, а для разрушения клеток в естественных образцах (почве, воде и др.) — механическое разрушение (см.
гл. 14). В том случае, если собираются проводить идентификацию бактерий, представленных колониями разных размеров на агаризованной среде, для уменьшения последующих погрешностей рекомендуется не просто смывать все колонии, а отобрать равное количество биомассы каждой колонии. Известно, что из 0,1 г сырой бактериальной биомассы может быть выделено 40 — 200 мкг ДНК в зависимости от вида бактерии и условий выращивания. При этом с увеличением объема биомассы, используемой для выделения ДНК, эффективность выделения снижается. Прп выделении НК из природных образцов, объем образца, используемого для выделения НК, зависит от предполагаемого обилия в пем микрооргапизмов, а также типа образца — вола, почва иля др. Так как в природных образцах, особенно в почвенпых, часто присутствует достаточно много гумицовых веществ, минимизация образца определяется и этим фактором. Обычно в случае почвенных образцов использук>т 0,5— 2,0 г почвы (в пересчете на сухое состояние образца).
Последовательность операций при разрушении клеток и экстрагированяи НК может быть следующей. В пластиковую пробирку на 15 мл вносят 2 г почвы, заливают 3 мл фосфатного буфера (120 мМ )Ча,НРО,/ХаНзРО,, рН 8,0), добавляют 3 г стеклянных стерильных бус размером 0,1 мм. Закрывают пробирку соответствующей пробкой и помещают ее на 30 с (или два раза по 15 с) во встряхиватель (Веад Веагег, Вгов и, Оеггпапу). В отсутствие специального встряхивателя суспензию образца в буфере гото- 146 вят в стерильной фарфоровой ступке.
Образец замораживают жидким азотом и пестиком растирают в течение примерно 5 мин до получения гомогенной массы. Метод применим также и для разрушения грибных гиф. Сравнительную информацию об этих и других методах можно найти в гл. 13. Вьшатение тотальной фракции нуклеиновых кислот обычно осуществляют после добавления додецилсульфата натрия (от 30 мкл 10%-го раствора), тщательного перечешивания и последующего внесения (от 0,5 мл) холодного водного (30%-го, рН 7,5— 8,0) раствора фенола (Ошпехе1с1 ет а!., 2001).
Смесь перемешиваю~ в руках (без тлспользования вортекса) и выдерживают на льду, после чего центрифугируют в течение 5 мин на настольной центрифуге при 15 тыс. об/мин при комнатной температуре. При этом содержимое пробирки расслаивается на верхнюю водную Фракпию и нижнюю — фенольную. Пипеткой отбирактт верхнюю часть супернатанта, стараясь не захваттггь нижнюю фенольную часть. Отобраннуто верхнюю часть смешивают с равным обьемом смеси хлороформа и изоамилового спирта (24: 1), перемешивают в руках и отбирают водную фазу. Добавляют к отобранной волной Фазе 0,1 объема 5 М !ЧаС1 и два объема холодного 96%-го зтанола.
Смесь выдерживают на льду в течение 20 мин пли 1 ч при -20 'С. После этого смесь опять центрифугируют Гб мин на центрифуге при 15 тыс. об/мин, но с охлаждением до — 6 С. Удалтттот супернатант и промывают осадок 1,5 мл 70%-го холодного этанола. Осадок выделенной ДНК должен быть бесцветным ~белым). Если изолированная ДНК остается окрашенной (различной интенсивности коричневый глтетток), то промывание спиртом повторяют. В этой же операции происходтлт и удаление соли.
Отмытую высокополимерную ДНК подсушивают на воздухе. После этого сухую ДНК растворяют в деионизированной воде и хранят в замороженном виде при -20 С. Часть полученного препарата ДНК может быль использована для определения процентного состава ГЦ-оснований ДНК и степени ДНК вЂ” ДНК гомологии, если ДНК была выделена из чистой культуры. Если тотальный препарат ДНК был выделен из образцов естественных субстратов, особенно почвы, компостов и др., фактически обязательной дополнительной стадией является очистка ДНК. Для этой цели лучше использовать наборы реактивов и приспособления (колонки), выпускаемые соответствующими компаниями. Одна из них — тт!хагс! 13(ЧА с1еаппр эузтеш (Ргогпева, (35А).
Инструкция по применению набора реактивов для дополнительной очистки ДНК прилагается к каждому набору. 10.2. АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ВЫДЕЛЕННОЙ И ОЧИЩЕННОЙ ДНК С ПОМОЩЬЮ ПЦР Для амплификации (увеличения числа копий) отдельных фрагментов или секвенсов (последовательностей) ДНК применяют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Она происходит, когда два олигонуклеотидных праймсра гибрилизуются на двуцепочечную матрицу ДНК с двух разных концов (5' и 3'), что позволяет ДНК-полимеразе синтезировать ДНК-последовательность, находящуюся между этими двумя праймерами (рис.
10.3). Для проведения ПЦР необходимо иметь: двухцепочечиую ДНК-матрицу, содержащую участок, который должен подвергнуться амплификации; праймеры (в избытке!), представляющие собой одноцепочечные фрагменты НК, которые могут <отжигап,э ~разъединять) нити ДНК, связываясь с того или другого конца с одной из цепей 147 Праймер 2 3'-коиец ДНК-матрица 5'-конец а между двумя ПЦР !К-полимеразы ПЦР-пр Плюс праймеры 3' и ДНК-полимераза Цикл 2 Рис. 10.3. Схема работы полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Каждый цикл синтеза участка между двумя праймсрами в ПЦР с помощью ДНК-полимеразы включает несколько последовательных ступеней, описанных в тексте ДНК-матрицы, в комплементарном праймеру участке; смесь (избыток!) четырех дезоксирибонуклеотидфосфатов (ДНФ), из которых будет синтезироваться новая ДНК; ДНК-полимераза — фермент, который осуществляет синтез нового фрагмента ДНК, апликона. В ПЦР обычно используют Таг)-ДНК-полимеразу, нысокотермостабильный фермент, полученный из термофильной бактерии Тагтиз аг7иаГ!сик.
Эта полимераза запатентована производящей ее фирмой. Кроме этих в реакционную смесь вносят также некоторые необходимые компоненты для стабильности протекания реакций. ПЦР-продукты, характеризующие большинство почненных бактерий, можно получить с использонанием бактериальных праймеров ()968 и Ы401 и схемы соединения — отсоединения праймеров в течение 30 тепловых циклов. 17-мерные праймеры Ь968 и 1.1401 предстанляют собой нуклеотидные последовательности, специфичные высококонсервативной 168 рДНК области прокариот и соответствующие положению у Е. сод между 968 и 984; 1385 и 1401 нуклеотидами хромосомной ДНК соответственно.
Структлура прайиароа: ()968 + ОС: зецисгюе 5' — (ОС с!акр)-ААС ОСО ААО ААС СТТ АС-3'. Ы40: зег)пеппе 5' — СОО ТОТ О ТА САА ОАС СС-3'. Компонент С С с!аптр (зажим, довесок), представляет собой 40-мерный фрагмент ДНК (5'-СОС ССО ООС ССС ОСС ССО ООС ОСО ОСО ОСО ОСА СОО ОСО О-3'), предназначенный для разделения продуктон ПЦР методом ДГГЗ. Типичная рабочая смесь (глаз!ег ппх), используемая для амплификации почвенных и ризосферных бактерий, содержит: 23,34 мкл деионизованной воды; 5 мкл специального буфера (згойе! Ьпйег), содержащего !00 мМ лзрис-НС1, ГОО мМ КС1, рН 8,3; 7,5 мкл (25мМ) М8С1,; 10 мкл смеси четырех нуклеотидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ТТФ и ЦТФ; 1 мкл (1О мМ) (3968 ОС праймера; ! мкл (10 мМ) Ы40! праймера; 0,5 мкл 100%-го формамида; 0,16 мкл белка Т4 гена 32 (белок, способствующий более стабильному протеканию реакции); 0,5 мкл Атр!з Гай Г)ИА Ро!угпегазе, 81ойе! Ггайзпепг (!0 ед/мкв); 1 мкл амплифицируемой ДНК.
Общий объем смеси составляет в данном случае 50 мкл (тап Гз!ерепшйеп ег а1., 2003). Приготовленную смесь до внесения образна амплифицируемой ДНК подвергают УФ-облучению в течение 3 мин для стерилизации раствора. Синхронность в работе ДНК-полимеразы и праймеров достигается за счет циклического изменения температуры смеси. Циклическое изменение температуры обеспечивает прибор амплификатор, работакпций в соответствии с введенной в него про- 148 Рис. 10.4.
Пример элсктрофореграммы продуктов ПЦР граммой. После каждого цикла в реакцию включается и продукт (ампликон) предыдущей реакции в качестве ДНК-матрицы. В результате имеет место геометрическая прогрессия увеличения количества ампликонов и после 30 — 40 циклов их концентрация достигает миллионов копий (ампликонов). Точность воспроизведения ампликона обеспечивается в сушественной степени качеством праймеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
