А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 46

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 46)

Гибридизация — зто процесс, в результатс которого две комплементарные здноцепочечные нити нуклеиновой кислоты образуют стабильную двуцепочечную спизаль. Реакция гибридизации может происходить между двумя комплементарными ни- 157 тами (молекулами) в растворе или между молекулами в растворе и комплементарными молекулами, иммобилизованными на тверлой подложке. Применение гибридизационного анализа на олигонуклеотидных микрочипах не только упрощает процедуру исследования, но и предоставляет принципиально новые возможности для одновременной идентификации и изучения целого ряда генетических покусов микроорганизмов и вирусов.

Технология биологических микрочипов позволяет автоматизировать процесс идентификации биологических объектов. Биологический микрочип — это некое упорядоченное множество микроскопических ячеек, каждая из которых содержит индивидуальный зонд и является, таким образом, самостоятельной реакционной единицей. Известно несколько принципиально разных подходов к изготовлению микрочипов (П)чА М(сгоаггауз, 1999). В Институте молекулярной биологии РАН традиционно разрабатываются так называемые трехмерные биочипы, каждая ячейка которых представляет собой микроскопическую каплю полиакриламидного геля (около 200 мкм то)пциной), в которой равномерно иммобилизованы ДНК-пробы.

Трехмерная пористая структура геля позволяет иммобилизовать пробы в гораздо большем количестве по сравнению с плоской поверхностью, а значит, повысить чувствительность анализа. В качестве ностителя для ячеек используются обычные предметные стекла, т. е, твердые, непористые подложки. ДНК-пробы — искусственно синтезированные олигонуклеотиды, состоящие обычно из 15 — 20 оснований.

Каждая из таких проб полностью соответствует (комплементарна) участку гена одного определенного микроорганизма или вируса, что и позволяет проводить их идентификацию. Чем больше таких проб на биочипе, тем больший спектр микроорганизмов или функций можно проанализировать на их наличие уши отсутствие в образце. Для осуществления анализа на микрочипе НК, содержащаяся в исследуемом образце, должна быть соответствующим образом подготовлена. В сш«чае анализа г спомной ДНК применяют подход ПЦР (полимеразная цепная реакция) для того, чтобы увеличить содержание в образце интересуюшего исследователя фрагмента ДНК.

Если же для анализа выбирается РНК, обычно применяют обратную транскрипцию с последующей амплификацией (ОТ-ПЦР). При этом праймеры, используемые в ПЦР, несут метку (чаще флуоресцентную), что позволяет полностью пометить все образующиеся ДНК-мишени. Альтернативным пгшходом является окрашиванис ДНК после ПЦР специальными красителями. В настоящее время имеется возможность готовить чипы с разноцветными флуореспирующими красителями. После подготовки исследуемого материала необходимо провести гибридизацию ДНК- мишеней с пробами, иммобилизованными на микрочипе. Процесс гибридизации проводят в гибридизационной камере. Время инкубации, температуру и влажность в камере подбирают экспериментально, осуществляя процесс при комнатной или при повышенной температуре, например при 62 С, с формамидом или без и т.д. Причем реакция идет лишь с теми пробами, которые соответствуют присутствующей в образце НК.

По истечении этого времени препарат промывают и далее наблюдают свечение. Поскольку НК, содержащиеся в образце, «переведеныь в форму сравнительно коротких ДНК-мишеней, несущих флуоресцентную метку, ячейки, где прошла реакция, начинают светиться. Исследователю остается лишь учесть, какие ячейки засветились, и сделать вывод о наличии в образце тех или иных микроорганизмов или вирусов.

При анализе (визуальном пол флуоресцентным микроскопом или после микросканирования и использования соответствующей программы — имидж-анализа) будут выявляться те светшциеся микропятна, где произошло связывание мишени с пробой. Сигналы рассматривают как значимые, если их свечение превышает некий пороговый уровень, который устанавливается в предварительных экспериментах. Дги изготовления биологических микрочипов должна быть проведена большая подготовительная работа.

Первоначально формулируется задача исследования, очерчивается спектр объектов, идентификация которых представляет интерес. После этого проводится выбор генетических мишеней — участков внутри геномов микроорганизмов, 158 последовательности которых характерны лишь лля представителей того или иного вида пли рода.

Можно избрать наиболее консервативные последовательности в генах, ответственных за синтез, например 168 — 188 или 238 — 288 рДНК и, слеловательно, в дальнейшем изготовленный чип будет распознавать определенную филогснетическую группу микроорганизмов, поэтому его можно назвать «филочипом».

Можно избрать последовательности, которые характеризуют искомый' организм по ьто некоторым, интересующим исследователя функциям, например по гену, ответственному за синтез веро- токсина у бактерии Е сод 0157: Н7. Тогда изготовленный чип следует называть «функшюнальным», Набранные нуклеотилные послеловательности в дальнейшем используются для конструирования праймеров. Основное требование, предьявляемое к праймерам, — их специфичность только к представителям одного таксона (вида или рода). Для проверки такой специфичности проводят так называемый ВЕАЯТ-анализ, т.е.

сравнение избранных последовательностей с последовательностями других микроорганизмов и вирусов. Если обнаруживается гомология выбранного праймера с участками геномов других организмов, такой праймер бракуется и процесс выбора повторяется. После этого осуществляют синтез праймеров, введение в них флуоресцентной метки, а также синтез проб для иммобилизации. Олигонуклеотидные пробы обычно имеют такие характеристики, как название !условное, дается разработчиком), специфичность, например универсальная (т.е. для всех бактерий), или группоспецифичная (например, для и-подгруппы протеобактерий), или функционально-специфичная и т.д., секвенс пробы в направлении от 5'- к 3'- концу, ! 68 рДНК связывающий сайт (обычно местоположение указывается по местоположению в 1сне !68 рДНК Е.

сод), процентный состав ГЦ-пробы, а также номер несоответствия с мишенью, в том случае сели такое несоответствие имеется. Дальнейший этап подготовки микрочипа — иммобилизация синтезированных ДН К- проб, по завершении которой чип формально можно считать готовым. Однако с этого чомента исследователь приступает к сто тестированию, после чего могут быть изменены последовательности проб, схема подготовки материала, условия проведения гибридизации, т.е.

формируется окончательный вариант метода анализа. С помощью технологии микрочипов, при наличии готовых чипов и соответствующего оборудования, квалифицированный специалист может провести анализ лостаточно большого количества образцов всего лишь в течение нескольких часов. Глава 11 ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами является правильное поддержание их в целях сохранения не только жизнеспособности клеток, но и таксономичсских, а также любых других, важных для исследователя свойств.

Микроорганизмы разных систематических групп и даже различныс штаммы и варианты одного вида отличаются чувствительностью к спосоэу их хранения. Поэтому общего метода, одинаково пригодного для хранения многочисленных и разнообразных групп микроорганизмов, пока нс существует. В крупных коллекциях разные группы микроорганизмов сохраняются индивидузльными методами.

Кроме того, чтобы исключить возможность потери микрозрганизма, каждый штамм сохраняется нс одним, а несколькими способами. Известно, что при хранении микроорганизмов в результате их популяционной изменчивости, обусловленной гстерогенностью популяции, изменяются 159 их физиолого-биохимические особенности и, в частности, снижается антибиотическая или ферментативная активность. В процессе хранения, так же как и при культивировании бактерий в различных условиях, может происходить диссоциация, т.е. расщепление однородной популяции бактерий на варианты, различающиеся генетическими, физиолого-биохимическими и морфологическими свойствами.

Поэтому в некоторых случаях целесообразно подбирать условия хранения, оптимальные лля определенного варианта, например для варианта, обладающего наибольшей биосинтетической активностью. К числу наиболее распространенных способов хранения микроорганизмов относятся периодические пересевы на свежие питкгельные среды, сохранение культур на питателытой среде под вазелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном состоянии. Значительно реже микроорганизмы сохраняют при низких или сверхнизких температурах, в листиллировашюй воде или 1%-м растворе хлористого натрия, а также на адсорбентах в высушенном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от целей, для которых используются микроорганизмы, а также от имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.

Характеристики

Список файлов книги