А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Метод тепловой деиатурации основан на разрушении водородных связей между комплементарными цепяьш пативной ДНК и их расхождении друг от лруга при повышении температуры раствора ДНК. Однонитевые ДНК поглощают при ~. = 260 нм примерно на 40 % больше, чем двунитевые. При нагревании раствора ДНК процент однонитевых ДНК увеличивается и наблюдается увеличение поглощения при 260 нм (гиперхромизм). Термостабильность водородных связей между гуанином и цитозином в ДНК выше по сравнению со связями между аденином и тимином. Поэтому, чем выше содержание Г + Ц- пар в молекуле ДНК, тем больше энергии требуется для расхождения нитей.
После расхождения цепей ДНК поглощение при 260 нм раствора с повышением температуры далее не увеличивается. Значение температуры плавления ('Г„,) соответствует температуре, при которой в растворе содержится 50 % разошедшихся нитей ДНК (температура 50%-го гиперхромизма). Эти значения линейно соответствуют молярному содержанию П1 в ДНК между 30 и 70 %. Широко используют следующую люодификаяию этого метода. Раствор ДНК доводят ло плотности приблизительно 25 мкг/мл (А,~а = 0,50) в 10-миллиметоовых кварцевых кюветах с герметичными крышками и термопарой (фиксирующей температуру), конец которой должен быть непосредственно под поверхностью раствора.
Кюветы помещают в регистрирующий спектрофотометр с 171 термостатирующим устройством. Температуру устанавливают равной 25 'С и регистрируют поглощение в опытной кювете при 260 нм против контрольной (с растворителем). Температуру медленно повышают (0,5 'С/мин) и проводят постоянную регистрацию изменения поглощения. Значение температуры, дающее 50%-е увеличение поглощения, будет соответствовать значению Т для данной ДНК. Поскольку значения молярного содержания ГЦ (%) и Т,„связаны линейно, расчет для неизвестной ДНК производится сравнительно просто.
На расчеты влияют концентрации буферных растворов, в которых проводят измерения, так как значение Т„логарифмически зависит от концентрации иона натрия в растворе. При измерении значений тепловой денатурации наиболее широко применяется цитратно-солевой буфер (1. БЗС, 0,015 М трехзамещенного цитрата натрия в О,!5 М ХаС1, рН 7,0). Для этого буферного раствора установлено следующее соотношение: молярное содержание ГЦ, % = 244 ҄— 169,00. В случае ДНК с высоким молярным содержанием ГЦ используют более разбавленные буферные растворы, например 0,33- или 0,1-кратный раствор ЯЯС. Для таких растворов уравнения выглядят следующим образом: О,ЗЗБЯС: молярное содержание ГЦ, % = 2,47 Т,„— 135,14; 0,33ЯЯС: молярнос содержание ГЦ, % = 2,08 Т„, — 106,40.
В целях воспроизводимости результатов, проверки метода и аппаратуры необходимо регулярно определять данным методом содержание ГЦ в ДНК из Е. со!! АГСС 11775, поскольку этот штамм является международным стандартом и Т его ДНК в 1 ЗЗС равна 90,5'С, а значение плавучей плотности— 1,710. Метод определения состава ДНК по плавучей плотности основан на том, что, если раствор ДНК подвергнуть высокоскоростному центрифугированию в градиенте плотности СзС1, то через определенное время она займет в градиенте место, соответствующее своей плавучей плотности. Значение плотности ДНК в середине пика, формируемого в центрифужной пробирке, называется плавучей плотностью ДНК. Она линейно зависит от молярного содержания ГЦ, % Метод был впервые описан в 1962 г.
и с тех пор не претерпел значительных модификаций. Измерение плавучей плотности ДНК производят следующим образом. Сухой СаС! растворяют в буфере (50 мМ тряс-НС1, рН 7,3) до плотности 1,7 г/ем~ и вносят 2 — 3 мкг исследуемой и реперной (с известным составом) ДНК. Растворы переносят в чистые и сухие центрифужные пробирки, помещают в аналитическую центрифугу и центрифугирукп при 150 тыс. я в течение 20 ч при 25'С. За это время градиент обычно формируется полностью. Плавучая плотность неизвестной ДНК рассчитывается с использованием расстояния между серединой ее пика и серединой пика реперной ДНК на градиенте плотности СзС1.
Маркерная ДНК должна быть выбрана заранее, чтобы ее пик не перекрывал пик определяемой ДНК. Нуклеотидный состав ДНК и ее плотность (р) связаны зависимостью: р = 1,660 + 0,098(Г + Ц). 172 12.2.3. Определение иуклеотидного состава ДНК методами хроматограФии Для определения нуклеотидного состава используют препаравы ДЕ1К, получение путем депрогпеинизации. Если выделение нативного препарата ДНК по каким-либо причинам невозможно, то для изучения нуклеотидного состава используют навеску в 200 — 500 мг биомассы. Исследуемый материал без предварительного удаления кислоторастворимой фракции подвергают щелочному гидролизу 0,75 н.
ХаОН при 37 С в течение 18 ч. Использование едкого патра вместо едкого калия для гидролиза обусловлено тем, что образующийся при последующей нейтрализации перхлорат натрия хорошо растворяется и полностью удаляется при отделении рибонуклеотидов от ДНК. После гидролиза суспензию охлаждают до 0 С, щелочь нейтрализуют 57%-й НС104 на холоде, затем доводят концентрацию кислоты до ! — 2 %. При этом в растворе остаются кислоторастворимые соединения (свободные нуклеотиды, мононуклеотилы РНК, фосфосахара и др.), а в осадок выпадают белки и ДНК.
Осадок, содержаший ДНК и белки, тшательно отмывают ат кислоторастворимых веществ холодной 0,2 н. НС1О„при центрифугировании, а затем обрабатывают спиртом, смесью спирт — эфир и эфиром и помещают для полного высушивания в вакуум-эксикатор. Высушенный остаток, содержащий ДНК, переносят в толстостенную центрифужную пробирку, заливают 8 — 10 мл 10%-го раствора НаС1, тщательно размешивают, добавляют несколько капель насыщенного раствора МаНСОз до рН 7,5 — 8„0 и нагревают на кипящей водяной бане в течение часа. При нагревании постоянно следят за тем, чтобы реакция суспензии оставалась нейтральной или слабошелочной, поскольку при подкислении отщепляются пуриновые основания. При сильном вспенивании суспензии к ней добавляют несколько капель изоамилового спирта.
В результате нагревания с НаС1 ДНК переходит в раствор в виде натриевой соли и происходит ее частичная депротеинизация (освобождение от белков). Раствор, содержащий ДНК, отделяют от денатурированных белков центрифугированием при 5 — 10 тыс. б в течение 20 мин. Осадок дважды промывают небольшими порциями 10%-го раствора ИаС1 и отбрасывают. Промывные воды обьединяют с основным селевым раствором ДНК. Раствор нейтрализуют 0,5 н.
НС1 до рН 6,0 — 6,5, прибавляют 3 объема 96%-го спирта и оставляют на ночь на холоду для выпадения осадка ДНК. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, дважды промывают 70%-м спиртом для удаления избытка соли, а затем дважды — 96%-м спиртом и один раз — эфиром для высушивания. Высушенный осадок ДНК хранится долго. Для лучшего высушивания и удаления эфира осадок ДНК распределяют стеклянной палочкой по стенкам центрифужного стакана, затем помещают в вакуум-эксикатор. Гидролиз ДНК.
Для гидролиза ДНК до оснований высушенную ДНК переносят в стеклянную ампулу и добавляют 72%-ю НС104 (на 1 мг ДНК берут около 30 мкл хлорной кислоты). Большой избыток хлорной кислоты приводит к значительному разложению тимина, поэтому для гидролиза ДНК используют минимальное количество кислоты, добавляя ее с таким расчетом, чтобы только полностью смочить осадок ДНК.
Затем ампулу запаивают (глаза обязательно должны быть защищены очками)) и проводят гидролиз на кипящей водяной бане или в термостате при 105 'С в течение часа. Под действием кон- 173 центрированной НС104 ДНК полностью гидролизуется с отщеплением азотистых оснований. По окончании гидролиза ампулу охлаждают, заворачивают в полотенце, осторожно вскрывают (аккуратно надпиливая и надламывая) и добавляют к гидролизату О,1 — 0,5 мл воды. Содержимое ампулы тщательно перемешивают и нейтрализуют по универсальному индикатору, прибавляя по каплям 40%-й раствор КОН.
Слабокислый гидролизат отлеляют от осадка путем фильтрования через стеклянный фильтр или центрифугированием, при необходимости упаривают до небольшого объема и используют для хроматографического разделения азотистых оснований на бумаге или в тонком слое целлюлозы. Гидролизат ДНК можно наносить на хроматографическую бумагу и без предварительной нейтрализации кислоты КОН. В этом случае к гидролизату ДНК добавляют несколько капель воды и перемешивают. В чашку Петри наливают 14%-й раствор аммиака.
На нее кладут хроматограмму так, чтобы стартовая линия находилась над аммиаком. Затем наносят гидролизат ДНК. Хроматография оснований иа бумаге. Для разделения оснований используют отечественную «медленную» или «среднюю» хроматографическую бумагу, а также сходные импортные сорта. Бумагу предварительно промывают 2 и. раствором СН,СООН. На прямоугольную полоску хроматографической бумаги на расстоянии 4 см от ее верхнего края наносят с помощью капилляра гилролизат ДНК в виде штрихов длиной ! — 2 см.
В один штрих наносят обычно объем гидролизата, соответствующий 300 — 400 мкг ДНК. Расстояние между образцами лолжно быть не менее 2 см, Одну полосу шириной 5 см, контрольную, оставляют на бумаге свободной. На дно хроматографичсской камеры ~ашивают растворитель слоем 1,5 — 2 см, а затем помешают в нее лист бумаги таким образом, чтобы ее верхний край был неподвижно закреплен„а нижний, на котором нанесен гидролизат, погружен в раствори- тель на ! — 1,5 см.
Для разделения оснований на бумаге или в тонком слое целлкшозы используют следующие системы растворителей: 1) кислый растворитель Кирби: метанол — концентрированная НС! — вода (75: 20: 15); 2) изопропанол — конце~ прированная НС! — вода (170: 45: 35); 3) щелочной растворитель Уайта: н-бутанол — вода — концентрированный аммиак (60: 10: 0,1); 4) н-бутанол — вода (43: 7), в газовой фазе концентрированнный аммиак (наливают аммиак в чашку Петри и помещают на дно камеры). Растворитель пропускают через бумагу или слой сорбента на пластинке обычно один раз: при этом происходит удовлетворительное разделение оснований. В кислых системах (1 и 2) разделение оснований при комнатной температуре происходит за 18 — 20 ч.
На хроматгярамме в направлении от старта к фронту основания располагаются следующим образом: Г, А, Ц, Т. В системе 2 отделяется также 5-метилцитозин (МЦ), который располагается между Ц и Т. В щелочной системе 3 при комнатной температуре разделение оснований происходит обычно за 36 — 48 ч, при этом основания располагаются в направлении от старта к фронту в следуклцем порядке: Г, Ц, МЦ, А и Т. Этот растворитель (3) очень удобен для определения небольших количеств оснований, так как на хроматограммах всегда обнаруживаются компаюные пятна всех оснований, за исключением гуанина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
