А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 51
Текст из файла (страница 51)
В кислых растворителях пятна оснований оказываются гораздо более размыты. Для отделю ~ия 6-метилаланина (6-МА) от других оснований применяют систему 4. Существенным недостатком щелочного растворителя является то, что в нем не удается количественно отделить и определить гуанин. Это объясняется тем, что гуанин хорошо растворим только в кислых распюрах, поэтому на хроматограммах после про- 174 пускания растворителя Уайта гуанин образует «хвосты» и не вымывается полностью со старта. В связи с этим лля определения количества всех азотистых оснований в ДНК проводят параллельно разделение одно1ю и того же гидролизата в двух системах растворителей (чаще всего 2 и 3).
При разделении оснований в системе 3 содержание гуанина не учитывают, а определяют только содержание других оснований: Ц, А, Т и иногда МЦ. При разделении оснований в кислом растворителе 2 определяют только количества Г и А, а затем рассчитывают отношение Г/А. Используя это отношение и полученные ранее данные по содержанию Ц, А и Т, окончательно рассчитывают нуклеотидный состав данного препарата ДНК. Пятна оснований обнаруживают по поглощению УФ-света, очерчивают простым карандашом, нарезают на полоски 2 — 3 мм и элюируют 5 мл 0,1 н НС! при 37 С в течение ночи.
Против каждого пятна основания из контрольной полоски вырезают участок бумаги такого же размера и элюируют его в тех же условиях. Гуанин растворяется в 0,1 и. НС! несколько хуже, чем другие основания, поэтому для его элюции обычно используют 0,5 н. НС!. Тем же раствором элюируют и контроль для гуацина. После элюции содержимое пробирок осторожно перемешивают, дают осесть ворсинкам бумаги и спектрофотометрнруют против элк>атов из соответствующих контрольных участков хроматограмм.
Хроматография оснований в тонком слое целлюлозы. Для приготовления хроматографнческих пластин используют стеклянные пластинки, размеры которых определяются параметрами хроматографической камеры. Их тшателыю»юк>т стиральным порошком (до равномерного стекания воды с поверхности), промывают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре. Мелкодисперснукз цслзк>лозу фирмы «Фильтрак» в количестве 1О г суспендирукзт в дистиллированной воде с таким расчетом, чтобы обьем полученной суспензии составил 100 мл, и перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 20 — 30 мин.
Полученную суспензию целлюлозы равномерно наносят на горизонтально расположенные стеклянные пластинки из расчета 20 мл на 120 см', которые затем высушивают при комнатной температуре. Нейтрализованный гидролизат ДНК наносят на слой целлюлозы с помощью капилляров в виде штрихов длиной 1 см на линии, отстоящей от нижнего края пластинки на 3 см. Чтобы пе допустить разрушения слоя целлюлозы, гидролизат наносят в виде серии расположенных друг за другом точек. В каждый штрих наносят обьем гидролизата, соответствующий от 200 до 600 мкг ДНК.
На каждой пластинке оставляют один свободный (контрольный) участок. Разделение оснований проводят в тех же системах растворителей, что и в случае хроматографии на бумаге (чаще всего 2 и 3). Пластинку помешают в хроматографическую камеру, на дно которой наливают растворитель слоем в 1 — 2 см, камеру герметически закрывают пришлифованной крышкой и проводят хроматографнческое разделение до тех пор, пока растворитель не дойдет до верхнего края пластинки. Высушенную пластинку просматривают на ультрахемоскопе при 260 нм в отраженном свете и очерчивают карандашом УФ-поглощение пятна оснований. Для каждого основания на свободном участке очерчивают равные по площади контрольные учаспси.
Затем все очерченные зоны соскабливают ланцетом пли бритвой в пробирки, наливают в каждую пробирку по 3 — 5 мл элюирующего раствора и проводят элюцшо оснований в течение 2 — 5 ч при 37 С. В качестве элюируюшего раствора используют (для всех оснований, кроме гуанина) 0,1 и. НС!, а для ~узница и соответствующего контроля — 0,5 н. НС!. По окончании элюции суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют: супернатанты спектрофотометрируют против контрольных элюатов.
Спектрофотометрня н проведение расчетов. Элюаты оснований, полученные в результате того или иного способа хроматографии, спектрофотометрируют при следующих длинах волн (нм); гуанин — 250 и 290; аденин — 260 и 290; цитозин — 276 и 290; 5-метилцитозин — 280 и 300; тимин — 260 и 290. 175 Для расчета колнчесгва оснований (мкмоль в ! мл злюата) используют коэффициенты: гуаннн — 0,1428 (Ам» вЂ” А,„а); аленин — 0,0792 (Ам« вЂ” Аззе); цнтознн — 0,1880 (Ане— Азы); 5-метнлцнтознн — О, 1786 (Азы — Азее); тимин — 0,1486 (Ам« вЂ” Азы); 6-метнлаленнн — 0,1005 (Аая — Амр).
Количество всех оснований суммируют, сумму принимают за !00% н определяют процентное содержание каждого основания в ДНК. Нуклеотнлный состав ДНК выражают в мояярных процентах Г + Ц. 12.3. ГИБРИДИЗАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Методы гибридизации ДНК вЂ” ДНК и ДНК вЂ” рРНК получили в последние годы широкое распространение при идентификации новых штаммов бактерий.
Они позволяют установить степень генетического родства изучаемого штамма с определенным родом, видом или выявить штаммовые различия. Принцип метода заключается в денатурации выделенной двухцепочсчной ДНК нагреванием и фиксации разошедшихся цепей на фильтрах. При понижении температуры возможна ренатурация цепей, причем соединиться с цепью может только комплементарная ей последовательность оснований, а температура связывания во многом определяет результаты опыта, Количество ренатурированной двуспиральной ДНК служит прямой мерой сходства геномов сравниваемых организмов, причем последовательности, образующие двуцепочечные комплексы, не обязательно комплементарны по всем нуклеотидам.
При гибридизации фрагменты одноцепочечной ДНК извеспюго микроорганизма (ДНК-репер) закрепляют на фильтре и добавляют радиоактивно меченные фрагменты одноцепочечной ДНК изучаемого штамма. Контролем служит связывание гомологичной реперу ДНК (100%-я гибридизация). Меченая ДНК (зонд) должна составлять в опыте не более 1: 300 — 1: 500 части от прикрепленной к фильтру немеченой ДНК-репера. Связывание зонда в пределах 100 — 70% считают штаммовыми различиями, 70 — 50% — различиями видовыми, менее 50 % — различиями на уровне рода. Данный метод удобен и объективен, однако может применяться лишь для определения сходства бактерий на уровне рода и более низком таксономическом уровне.
Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 13.1), выделяют ДНК, фрагментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300 — 350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-й агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах. ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нуклеозид- 5'-трифосфата при одновременном действии ДНКазы-1 и ДНК-полимеразы-1 Е. со!! и используют для гибридизации.
Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-м формамиде при 62'С в течение 18 — 24 ч («мягкая ренатурация»), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100 % и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степеныомологни молекул и служит показателем родства штаммов.
Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двой- 176 ные спирали образуются также между одноцспочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее эти методы описаны в справочном руководстве (Ф.Герхард и др., 1984). 12.4. КАТАЛОГИЗАЦИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 58 И 168 рРНК . Методы гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-рРНК требуют прямого экспериментального сравнения изучаемых микроорганизмов. В отличие от этого метозы анализа генома, построенные на определении последовательностей нуклеогидов в высококонсервативных полимерных молекулах клетки, таких, как 53, 168 (!88) или 235 (285) рРНК, дают возможность оценивать данные, полученные в разное время и в разных лабораториях.
С помощью сравнения последовательностей нуклеопщов можно проводить филогснетический анализ любых организмов, как про-, так и эукариотных, и строить эволюционные леревья, что важно для определения степени их родства и путей эволюции жизни. Метод изучения последовательностей нуклеотидов 55 рРНК по сравнению с анализом 168 (или аналогичной 188 рРНК у эукариот) дает меньше информации (это понятно, если учитывать длину цепи молекул — 120 и 1500 — 1600 нуклеотидов соответственно), однако он более прост, быстр и дешев. Последовательности нуклеотидов сравнивают между собой лля получения коэффициента сходства (Зхв), характеризующего подобие нуклеотидов у организмов А и В.
Коэффициент (Юьв) рассчитывают пугем деления суммы нуюгеапщных остатков, находящихся н общих для двух организмов нуклеотидах, на сумму нуклеотидных остатков, содержащихся во всех сравниваемых нуклеотидах, определенных у организмов А и В. Коэффициенты Ядв используют для построения лендрограмм, которые рассматривают как филогенетические деревья. Подробнее эти методы описаны в справочном руководстве (Ф. Герхард и др., 1984). 12.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПОЛИ-)з-ОКСИггггАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ Многие бактерии образуют поли-1)-оксимасляную кислоту (ПБОМК) и другие полимеры на основе оксижирных кислот и их производных в качестве внутриклеточного запасного продукта. Иногда способность к такому синтезу служит диагностическим признаком.
Проведение овределелия. Для экстракции ПБОМК из клеток биомассу после осажзения высушивают слгесью лиэтилового эфира и метанола в соотношении объемов 1: 1. Сухую биомассу освобождают от остатков растворителей в вытяжном шкафу. Осадок растирают в ступке Ло порошкообразного состояния и взвешивакхг. Если для анализа зерут сухую биомассу, то этап высушивания смесью растворителей пропускают. ПБМОК зкстрагируют из навески биомассы смесью хлороформа и метанола (в объемном соотношении 2: 1) прн 60 С.
Экстрагированне проводят в колбе или пробирке с притертой и прижатой пробкой (во избежание ее выталкивания при испарении раство- 177 рителей и подъема давления внутри колбы или пробирки), помещенных в водяную термостатированную баню. Для экстракции берут 5 мл смеси растворителей на 0,5 г сухих клеток. Экстракцию ведут в течение 20 мин при периодическом покачивании содержимого, зятем экстракт сливают с осадка и экстракцию повторяют. После экстракции осадок биомассы отбрасывают. Объединенные экстракты фильтруют через стеклянный фильтр и упаривакгт досуха под вакуумом или в вытяжном шкафу в фарфоровой чашке на кипящей водяной бане.
Осадок после упаривания растворяют в 1 н. серной кислоте (5 мл на каждый грамм высушенной исходной биомассы) и ПБОМК гидролизуют в течение 2 ч на кипящей водяной бане или в термостате при 100 — !05 С. Гидролизат фильтруют через стеклянный фильтр под вакуумом, доводят его объем до 5 мл 1 н, серпой кислотой и измеряют экстинкцию при 235 нм против серной кислоты на спектрофотометре. Калибровочную кривую строят по 3-гидроксимасляной кислоте с кислотной обработкой ее параллельно опьпной пробе. 12.6. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ Полисахариды, образуемые микроорганизмами, входят в состав ряда компонентов клеток, в частности в клеточную стенку, служат запасными веществами, локализуются внутри и вне клетки. Внеклеточные полисахариды могут быль капсульными или свободными. ь1асто полисахариды определяют антигенную специФичность штамма, выполняют защитную Функцию, играя роль барьера проницаемости для молекул, ионов или препятствуют потере ктеткой-влаги.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
