А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 48
Текст из файла (страница 48)
Суспензию клеток с высокой плотностью (1Оз — 1О'о клеток в 1 мл) разливают в ампулы или флаконы с завинчивающейся крышкой, Ампулы запаивают и помещают в холодильник с температурой — 70 С (скорость охлаждения 1 С/с), а затем переносят в жидкий азот, где и сохраняют при — 196 'С. Оттаивание замороженных клеток должно быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружа- 164 ют на 2 мин в водяную баню с температурой 35 — 45 'С. Клетки из ампул высевают на богатые питательные среды.
При температуре хранения от -20 до -40 "С хорошо выживают немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение при -70 С в твердой углекислоте и особенно в условиях сверхнизких температур: при — ! 96 С (жидкий азот) или при — 210 'С (газовая фаза жидкого азота).
11.5. ХРАНЕНИЕ В ГЛИЦЕРОЛЕ Одним из самых удобных методов хранения микроорганизмов является их содержание при низких температурах ( — 20 'С) в растворах глицерола, который служит криопротектором. Данный способ широко распространен, однако не все микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому считается, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле, необходимы предварительные эксперименты по определению степени их выживаемости. Наибольшее распространение этот способ консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий различных спор. Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%-й раствор глицерола в дистиллированной воде и стерилизуют его при ! ати в течение 30 мин.
Клетки из выросших культур (обычно из середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные для хранения, смешивают в пропорции 1: 1 с 50%-м глицеролом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии удобно в стерильных пробирках Эппендорф, а для их приготовления использовать автоматические пипетки со стерильными наконечниками и готовить смеси в ламинарном шкафу. Из сохраняемых клеток периодически (2 — 6 раз в год) отбирают пробы для проверки на выживаемость. В зависимости от результатов проверки рассчитывают схемы консервапии той или иной культуры и периоличности их пересева. Для культур микроорганизмов с твердых сред перед смешиванием с глицеролом готовят суспензии в жидкой среде или в оптимальном для хранения буферном растворе (проверяется экспериментально).
Можно также суспендировать клетки с твердых сред непосредственно в 25%-м стерильном глицероле. 11.6. ХРАНЕНИЕ В ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДЕ ИЛИ 1%-ы РАСТВОРЕ ХЛОРИДА НАТРИЯ Этот метод нс требует специального оборудования и доступен любому экспериментатору. Микроорганизмы предварительно вырашнвают в оптимальных условиях, при необходимости центрифугируют, после чего клетки суспендируют в дистиллированной воде или 1%-м растворе хлорида натрия. Успешному сохраненню клеток способствует высокая плотность суспензии: не менее 10' — 1О" клеток в 1 мл.
Суспензию разливают в стерильные пробирки или флаконы и сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре. Рекомендуется оставлять на Таблица 11.2 Донустимые сроки хранения (мес) микроорганизмов в холодильнике (4 — б 'С) в дистиллированной воде и 1%-м растворе 1ЧаС! хранение клетки начала стационарной фазы роста культуры или сформировавшиеся покоящиеся формы — споры, цисты. Допустимые сроки хранения некоторых микроорганизмов этими методами в холодильнике при 4 — б С приведены в табл.
11.2. 11.7. ХРАНЕНИЕ В ВЫСУШЕННОМ СОСТОЯНИИ НА АДСОРБЕНТАХ Этот метод применяют главным образом для актиномицстов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагелгч вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техники этот способ не имеет. В самом общем виде он сводится к тому, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Илгеются данньге, что у актиномицетов после хранения в почве или кварцевом песке восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окраска воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены в процессе длительного культивирования в лаборатории.
11.8. ОЦЕНКА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ Жнзнесгюсобность микроорганизмов после различных сроков хранения определяют путем высева их на богатые питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Процент выживаемости микроорганизмов находят по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100%.
!бб Глава 12 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ 12.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА Содержание белка можно измерять непосредственно в нерассеивающих (истинных) растворах или после проведения гидролиза клеток и отдельных клеточных структур. Для каждого эксперимента выбирают методы, которые удовлетворяют по скорости, точности и удобству измерений. При определении строят калибровочные кривые, анализируя известное количество белка в тех же условиях, что и опытные пробы. Если перед проведением определения содержания белка требуется гидролиз материала, необходимо в тех же условиях провести и гидролиз стандарта, используемого для построения калибровочного графика. Во всех случаях необходимо учитывать только те значения графика, которые лежат в области 0,1 — 0,7 оптической единицы в кювете с длиной оптического пути 10 мм, при этом значения поглощения опытных образцов должны находиться в пределах полученных экспериментальных точек калибровочного графика.
В необходимых случаях проводят кратные разведения исходного материала. Калибровочные кривые строят с использованием растворов альбуминов— бычьего сывороточного, яичного или из сыворотки человека. 12.1 1. Измерение поглощения при длине волны 280 нм Преимущество этого наиболее простого и быстрого метода измерения количества белка в содержащих его нерассеивающих растворах — быстрота и неизменность пробы до и после анализа. Метод применим для измерения концентраций белка и в растворах смесей белков.
К недостаткам следует отнести то, что метод не является строго количественным, так как основан на поглощении тирозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков. Вследствие этого белки отличаются коэффициентами поглоп!ения. Если белок не содержит вышеуказанных аминокислот, то он не будет поглощать при 280 нм. Для болыпинства рутинных измерений можно с большой вероятностью допустить, что поглощение при длине волны (Х) 280 нм раствором белка с концентрацией 1 мг/мл даст значение оптической плотности А1зе около 1 единицы в кювете с рабочим расстоянием 10 мм.
Более скрупулезные исследования показывают, однако, что поглощение в растворах с одинаковой концентрацией белков может значительно различаться (табл. 12.1). Область чувствительности метода лежит в пределах от 0,2 до 2,0 мг белка/мл, а в микрокюветах возможно измерение -0,05 мг белка (0,1 мл пробы). Для измерения необходим спектрофогометр, позволяющий регистрировать ближнюю ультрафиолетовую область спектра, кварцевые кюветы и пипетки для переноса образцов. При измерении выставляют значение спектрофотометра при !.
= 280 нм на 0 поглощения в кювете с экспериментальным буферным раствором, затем в той 167 Таблица 12,1 Различия в воглощеиии растворами некоторых белков же или аналогичной кювете измеряют поглощение белком в таком же буфере. При измерении с помощью двухлучевого спектрофотометра устанавливают значение прибора на 0 при длине волны 7, = 280 нм и измеряют образец против контроля с соответствующим буферным раствором. Стеклянные и пластиковые кюветы сами по себе значительно поглощают УФ-лучи, поэтому при измерении вышеописанным методом их не используют. Если поглощение слишком велико, можно использовать кюветы с более короткими рабочими расстояниями, когда разбавление пробы нежелательно.
Оптический метод широко используется для быстрого неразрушающего определения концентрации белков, например при кслоночной хроматографии белков. Однако не любое поглощение'лучей с длиной волны 280 нм можно принимать за белковое, так как значительный вклад в абсорбцию могут вносить присутствующие в пробе нуклеиновыс кислоты (максимум их поглощения при Х = 260 нм). Если измеряемый образец сильно загрязнен нуклеиновыми кислотами, то более точно концентрация белка вычисляется по формуле, учитывающей вклад абсорбции при 260 нм: концентрация белка (мг/мл) = 1,5 Алв — 0,75 Амж Результаты эксперимента показывают, что если величина Азы — Аж~ приблизительно равна 2,0, то содержание нуклеиновых кислот в исследуемой пробе незначительно. При высоком содержании нуклеиновых кислот гораздо более точным является определение белка по Брэдфорд.
12 1.2. Определение белка по Брэдфорд Это быстрый. и удобный метод измерения концентрации растворенных белков, основанный на количественном связывании белков с красителем. Он неприменим для измерения количества белка в рассеивающих образцах. Хотя число соединений, мешающих определению белка этим методом, сравнительно невелико, краситель в большей или меньшей степени реагирует с различными очищенными белками.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
