А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 45
Текст из файла (страница 45)
пример на рис. 10.1). С учетом некоторых особенностей и ограничений, перечисленных во введении, результаты ДГГЕ-анализа могут быть интерпретированы следующил1 образом. Формально каждая полоса (ампликон) принадлежит соответствующему виду. Слеловательно, подсчет количества полос в каждой дорожке является одной из характеристик микроорганизмов анализируемого образца. Имеет значение и расстояние каждой полосы от начала фореграммы. Это расстояние зависит от нуклеотидного состава ампликона. Расстояние лучше рассчитывать в относительных единицах, т.е.
относительно соответствующих контролей, маркеров, которые обычно располагают по краям форе- граммы, а иногда еше и в середине. В качестве маркеров используют синтетическую смесь амплифицированных 165 рДНК бактериальных клонов с известными различиями в ленатурирующих характеристиках. В реальных исследованиях хорошо зарекоменловали себя маркеры, являющиеся фрагментами 165 рДНК клонов бактерий: ЕиЬас!елит Ьа(й А07, ЕизоЬае!епит ргаиеа(уейч!1)ге А10, Виб»уи'Ьпо3Утйо!иелз-11'ке А! 1, Еиьае!елуит р!аи!й!Гке А27, С!азате(гит се(егеоеегенз-11«с Л54, Виттосоесиа оЬеит-йке А57, ЕиЬаг!енит (агаве(яелегале-1йке А71 (39] и ВВи(оЬае!ее!от ХН.
Существенное значение имеет и оптическая плотность полос. Последний показатель отражает концентрацию идентичных змпликонов и фактически количество ДНК (количество клеток) соответствующей бактерии в исходном образце. Плотность полос на ДГГЭ-фореграмме анализируют после сканирования каждой фореграммы и перенесения информации в компьютер. Для анализа плотности полос используют специальную программу Р1югебх !П (!чоп!лпеаг Пупаш!сз Ь!б., !чел»сваг!е проп Туве, НК).
В настоящее время лля анализа сложных фореграмм, получаемых в результате анализа природных образцов, используют комплекс специальных компьютерных программ, совмещенных со статистическим анализом результатов. В качестве примера такого комплексного подхода можно рекол1енловать ю1астерный анализ, дискримипантный анализ (БАВ !пабгше, !пс., Сагу, 1)БЛ), индекс Шенона и др. 10.4. ВЫЯВЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ Р! ЗН-МЕТОДОМ Для выявления и определения микроорганизмов в природных образцах и после выращивания нх на средах разработан метод гибридизации флуоресцирующих олигомерных нуклеотидных последовательностей с нуклеиновыми кислотами целых клеток — Опогезсепг !и 61!и ЬуЬг!г((гаг)оп (Р(БН). Традиционно для выявления присутствия какого-либо микроорганизма в той или иной природной среде обитания нли в накопительной культуре нужно оыло выделить этот микроорганизм в чистую культуру и провести его идентификацию.
Позднее были разработаны иммунофлуоресцентныс методы (ИФМ), позволяющие выявить интересующий исследователя организм без выделения в чистую культуру. В основе любых модификаций ИФМ используется взаимодействие антиген — аптитело, которое соединено с флуоресцирующим красителем. Специфичность реакции антиген — антитело высока, поэтому и вероятность выявления искомого микроорганизма в природных образцах или накопительных культурах тоже высока. Недостатком являются относительно долгая процедура приготовления сывороток с флуоресцирующими красителями, существование перекрсстных реакций, а самое главное — «удаленность» реак- 155 ции антиген — антитело от генетического кода исследуемого организма.
И хотя ИФМ используются широко„в настоящее время получают преимущество методы, основанные на идентификации специфических для конкретного организма нуклеотидных последовательностей ДНК (рРНК). К таким методам относятся уже упомянутый Д1ТЭ, клонирование и секвенс специфических последовательностей ДНК.
Однако и эти методы тоже имеют свои недостатки, и главный из них — использование ПЦР, результаты которой пока еще не могут быть точно аконвертированы» в численность конкретного микроорганизма. Недостатков ИФМ и некоторых молекулярно-биологических методов лишен метод, основанный на взаимодействии окрашенных флуоресцентно олигонуклеотидных проб с соответствующими участками 16Б рРНК целых клеток (Р!БН). Более того, с помощью этого метода можно учитывать даже не культивирусмые на средах микроорганизмы. Из названия метода ясно, что этот метод предполагает использование Флуоресцензт1ой микроскопии, поэтому возможно его применение для количественного учета клеток микроорганизмов и метода проточной флуороцитометрии (ПФЦМ).
Естественно, как и любой другой метод, Г1Я1 имеет свои особенности. Например, его чувствительность зависит от типа используемого для исследований образца, примененной молекулярной пробы, вида красителя, эффективности окрашивания (связывания) пробы с красителем, условий проведения гибридизации и др. Для использования Р1ЯН-метода необхолимо иметь олигонуклеотидные пробы, которые могут быль синтезированы, если исследователь знает последовательности нуклеотидов в 165 рДНК. Полезнал информация для создания соответствующих проб может быть получена в базе данных «К(Ьозопза1 ВагаЬазе Рго)ась*. Ниже приводится достаточно подробная методика вьивления и учета бактерий в образцах, в частности для выявления Яиаплосассиг аЬеит-подобных бактерий с помощью флуоресцентной микроскопии.
Как отмечалось, условия гибридизации для разных микроорганизмов должны подбираться индивидуально. Исследуемые образцы должны быль подготовлены, как и в случае традиционного учета микроорганизмов с использованием флуоресцентного микроскопа, т.е. должна быть проведена десорбция клеток, если, например, образец содержит какую-либо твердую фракцию, подобрано оптимальное разведение и т.л. На поверхность предметных стекол, предварительно покрытых тонким слоем желатины, наносится определенный объем исследуемого образца. Стекло с образцом высушивают 20 мин при 45 'С.
Подсушенные препараты подвергают дегидратации, погружая препарат на 2 — 3 мин в ряд с увеличивающимися концентрациями (градиент) растворов этанола от 50 до 75% и далее до 96 %. После этого на препарат наносят 1О мкл .гибридизационнош> буфера (0,9 М НаС1; 20 мМ гарле-НС1 рН 7,5; 0,1%-й додепилсулыЬата натрия, ДСН). Используемый объем гибридизационного буфера должен содержать (для ланной конкретной методики и с учетом используемого объема), например, 3 нг СуЗ-меченной НгоЬе63 пробы на каждый микролитр или 5 нг флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ)-меченной Егес482 пробы на каждый микролитр. Затем препарат помещают в термостат (лредаталаи1ал ега аыгыхиние1) и инкубируют при 50 С в течение 3 ч в темноте. После процесса гибридизации препараты промывают с покачиванием, помещая на 10 — 20 мин в 50 мл гибрилизационного буфера, но без ЗП5.
Для того чтобы помимо выявления и учета искомого организма провести учет и тотального количества клеток в исследуемом природном образце, в промывочный бу- * Мандая дд ег аь ТЬс ИВР-11// Нис1. АсЫз аез. 2001. — Н. 29. — Р. 173 — 174. 156 фер можно добавить флуоресцентный краситель 1)АР1 в концентрации 100 нг/мл.
После промывачного буфера препараты следует промыть в воде и немедленно высушить на воздухе. Учет клеток с помощью флуоресцентного микроскопа проводят визуально или с помощью цифровой камеры и компьютера осуществляют имидж-анализ полученных снимков. Расчет количества клеток производят, как и при традиционном учете клеток, под микроскопом. Приготовленные препараты некоторос время можно хранить при -20'С. 10.5. ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОЧИПОВ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Высокоэффективное и быстрое выявление микроорганизмов и их идентификация в природных образцах — одна из основных задач практической микробиологии.
Другое важнейшее направление — выявление мутаций в геномах организмов и тестирование экспрессии генов. При решении этих задач все чаще применяются методы молекулярной биологии. Наибольшее значение такие методы приобретают в случаях, когда требуется в кратчайшие сроки проанализировать образец на присутствие болезнетворного агента„например для ограничения распространения высококонтагиозных заболеваний, либо если диагностика классическими культуральными методами трудоемка и занимает продолжительное время. Иммунпо-флуоресцентный анализ (ИФА) и Р(ЗН-метод (см. !0.4) позволяют специфично выявлять и учитывать клетки, содержащиеся в исслсдусмом образце. Однако ограничение обоих подходов заключается в возможности выявления микроорганизмов только того вида, к которым были приготовлены нммунные или ДНК-пробы (зонды).
Лля выявления клеток, принадлежащих к разным таксономическим елиницам в одном и том же образце, молекулярные зоны (помимо специфичности к разным микроорганизмам) должны нести различные метки, в противном случае их нельзя будет различить. Таким образом, первым лимитирующим фактором широкого использования Р15Н является число доступных красителей, вторым — проникновение молекулярной пробы в клетку и процесс связывания пробы с комплеые~ггарным участком нуклеиновой кислоты внутри клетки, третьим, не менее важным, — макроскопические размеры используемых стекол, а следовательно, большие затраты груда и дорогостоящих реагентов и др.
Одного нз первых двух недостатков лишен метод точечной гибридизации (дог-Ыог), когда на специальной подложке (например, Фильтре) закрегшяют молекулярную пробу (олнгонуклеотидную последовательность, часто радиоактивно меченную), принадлежащую искомому исследователем микроорганизму.
После этого на фильтр наносят лзолированный из образца раствор тотальной нуклеиновой кислоты (НК). После гибзвдизации и удаления несвязавшейся НК определяют, была ли в исследованной пробе НК, принадлежащая искомому организму, или нег. Однако этот метод, так же как и Р13Н, имеет недостаток, связанный с его макроскопичностью и, следовательно, высокой трудоемкостью. Многих недостатков методов г(ог-Ыог и Р10Н для анализа образцов на наличие мнкзоорганизмов и вирусов удалось избежать при использовании технологии биологических микро«илов (слово «чип» с английского языка переводится как «кристалл» нли «микро=хема»). Метод биологических микрочипов основан, как и множество других методов, на способности коьпшементарных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот к гибзвдизации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
