А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 47
Текст из файла (страница 47)
11.1. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПЕРЕСЕВЫ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Этот способ был одним из первых приемов длительного сохранения микроорганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени широко используется в практике микробиологических работ. Аэробные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхность скошенной агаризованной среды, микроаэрофилы — в полужидкую среду, содержащую 0,2 — 0,3 % агара, анаэробы — в толщу плотной среды или в жидкую среду, соблюдая принципы техники Р.
Хангейта. Культуры перссевают на свежие среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем микроорганизмы из одной пробирки используют для работы, а культуру во второй пробирке оставляют для хранения и следующего перссева. Частота пересева на свежую среду различных микроорганизмов неодинакова и в большей степени определяется их свойствами. Многие микроорганизмы можно пересевать один раз в 1 — 2 мес, хотя другие, например молочнокислые бактерии„нуждаются в более частых пересевах. Допустимые сроки пересева некоторых микроорганизмов приведены в табл. 1! .1.
Хранение культур в холодильнике при 4 — 6 С позволяет увеличить время между пересевами. Таблица 11.1 Условия хранения и допустимые сроки периодических пересевов некоторых гетеротрофных микроорганизмоя 160 Окончание табл. 11.1 Температура хранения, "С Число пере- севав в гол Питательная среда Мвкрооргвннзм . ;Вас!!!иь са еиь ,' В. ро!ут!>ха 'В. ьиМ!!1ь Картофельный агар 18 — 20 Агаризованная среда с дрожжевым авгплизатом ~ Саи!оЬасгег вр. ~ С!1гоЬасгег Яеипг!1! ЕусЛепсЛ!а соб 18 — 20 18 — 20 !8 — 20 МПА МПА МПБ + 0,2 Уб агара б !2 6 — 8 ХасгоЬас!!!иь сале! 18 — 20 Снятое молоко 18 — 20 8 — 10 'Б сусло+ + дробина + мел 18 — 20 18 — 20 йасгобас!!!иь г!е!ЬгиесЛ1! Леисопоьгос теьепгего1г!еу 18 — 20 М!сгососсиь 1игеиь М.
уапапь МПА + 3'Б сусло (1: 1) 18 — 20 3 — 4 4 — 6 18 — 20 2 — 3 3 — 4 18 — 20 МПА Рьеиг!отопаь аеги8!гтоьа Р. Виогеьсепь Р. ригЫа 4 — 6 Ргор1 оп 1Ьосгепит Яеиг!епгегс!уй Среды с кукурузным экстрактом или лактатом 4 — 5 18 — 20 МПА Ргосеиь ви18оль Р. ппгпМ1М 18 — 20 угар!уу!ососсиь а и геиь МПА 18 — 20 Агаризованная среда Чапека Овсяный агар ьггерготусеу апи!ала гаг.
Впуеиь Х 1атуепг!и!се Х Ио1асеиь' 4 — 5'Б сусло+ агар 18 — 20 Поддержание культур микроорганизмов регулярными псресевами имеет ряд сушественных недостатков. Основной из них — возможная утрата некоторых морфологических и физиологических признаков. Кроме того, частые пересевы нередко снижают биохимическую активность культур, повышают опасность инфицирования се посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидкие среды, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селскг!ия. 161 Но русов МусоЬасгепит Яатеьсепь м.
1огги!гит ; М. РЛ1ет 'М. ьтея па!И 1у'оса го!1а вр. ЯассЛоготусеь сегеьяиае Сапу!1г!а еи1!!1еппопг111 Г и!Ни ВЛоггогоги1а 8!и11п1ь' В. гибга усЛ!гоьассЛапутусеу ротЬе УоссЬаготусоби 1исбу18а 4 — 5 б 6 6 б 4 — 5 4 — 5 11.2. ХРАНЕНИЕ ПОД МИНЕРАЛЬНЫМ МАСЛОМ Хранение под минеральным маслом широко используется для бактерий и микроскопических грибов. Этот метод обеспечивает довольно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности таксономических и других признаков у микроорганизмов различных систематических групп. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет процессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересевами. Микроорганизмы выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде; аэробные микроорганизмы — на поверхности коротко скошенной (под.углом 45 ) среды, микроаэрофилы и факультативные анаэробы — в полу- жидкой среде, анаэробы — в толще среды (посев уколом или в расплавленную среду с перемешиванием).
Хорошо развившиеся культуры заливают маслом. Как правило, аспорогенные бактерии заливают через 2 — 7 сут после посева в зависимости от скорости роста микроорганизма, бациллы и актиномицеты — в стадии сформировавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать маслом через 4 — 1О, мицелиальные грибы — через 7 — 12 сут. Наиболее пригодно для заливки культур микроорганизмов высокоочищенное медицинское вазелиновое масло с плотностью 0,8 — 0,9. Предварительно масло стерилизуют 1 ч в автоклаве при 1 ати, а затем для удаления влаги прогревают в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре не выше! 50 С или оставляют на двое-трое суток при комнатной температуре.
Культуры заливают маслом так, чтобы его слой не превьппая 1 см над средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при комнатной температуре либо в холодильнике при 4 — б 'С. Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив излишек масла проведением петли по стенке пробирки, переносят на свежую питательную среду. Рекомендуется использовать среду того же состава, на которой культуру хранили.
Многие микроорганизмы в первом пассаже после хранения под маслом развиваются медленнее, однако при последующих пересевах скорость их роста восстанавливается. Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым маслом прост, удобен в обращении, может быть использован в любой лаборатории. К недостаткам его можно отнести возможность инфицирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания масла при обжигании петли, а также необходимость специальной очистки посуды от масла.
11.3. ХРАНЕНИЕ В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ Хранение лиофильно высушенных клеток — широко распространенный метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток.
Лиофильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом или в струе стерильного газа (чаше всего азота). Применение этого метода позволяет в течение 1Π— 20 лет и более сохранить без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток. 162 Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания формирования покоящихся форм. Затем клетки, или соответственно, покоягциеся формы суспендируют в специальных жидкостях, получивших название защитных еред.
В состав защитных сред входят различные вещества, которые предохраняют клетки от повреждений в период замораживания и высушивания. Ниже приведены рецепты некоторых защитных сред, используемых при лиофилизацин клеток различных микроорганизмов: ° желатин — 1 г, сахароза — 10 г, вода дистиллированная — 100 мл; ° молоко обезжиренное — 100 мл, глюкоза — 7 г; Рис. 11.1. Последовательность (1 — 6) вскрытия двухкамерной ампулы с лиофильно высушенными клетками микроорганизмов (а) и различных одиокамерных ампул (6) 163 ° молоко обезжиренное — 100 мл, )л!Н~С! — 0,5 г, аскорбиновая кислота— 0,5 г, тиомочевина — 0,5 г; ° лошадиная сыворотка — 75 мл, мясной бульон — 25 мл, глюкоза — 7,5 г.
Для успешной лиофилизации плотность микроорганизмов в защитной среде должна быть как можно более высокой: 10~ — 1О'о клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального стекла по 0,5 — 1,0 мл, замораживают при температуре от -20 до -70'С, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная влажность лиофилизированных клеток колеблется от ! до 6 % и определяется составом защитной среды и режимом высушивания. В различных лабораториях режимы замораживания и высушивания заметно варьируют и во многом зависят от имеющегося оборудования.
Ампулы с лиофильно высушенными клетками рекомендуется сохранять в темноте при температуре 4 — 6'С. Хранение при более высокой температуре, особенно превышающей 25 — 30 'С„заметно снижает выживаемость клеток. Для реактивации к лиофилизированным клеткам добавляют по каплям стерильную дистиллированную или водопроводную воду в количестве 0,5— 1,0 мл.
После регидратации (от 10 мин до 2 ч) клетки высевают на более богатые питательные среды (рис. 11.1). Лиофилизацию широко применяют для длительного хранения различных микроорганизмов. Тем не менее этот метод нельзя считать универсальным. Следует отметить, что к лиофилизации более устойчивы грамположительные, чем грамотрицательные бактерии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы.
Выживаемость спор после лиофилизации заметно выше, чем вегетативных клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов Р)еЫа и Иротусее выдерживают лиофилизацию лучше, чем слабоспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрожжей родов Яассоаготусее, К1иугеготусее, Кйойогоги!а.
11.4. ХРАНЕНИЕ ПРИ НИЗКИХ И СВЕРХНИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ Хранение микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверхнизких температурах по сравнению с другими методами характеризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод требует специального оборудования и большой осторожности в работе с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию. Клетки замораживают в широком диапазоне температур (от -10 до -196 'С) и при различных скоростях замораживания. Для защиты от повреждающего действия низких температур клетки предварительно суспецдируют в растворах криопротекторов. Чаще других применяют 10 — 20%-й раствор глицерина„7— 10%-й раствор диметилсульфоксида или 20%-й раствор сахарозы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
