А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Промыть водопроводной и ДИВ. Высушить стекла. Промыть чистым (96%) этанолом, протереть чистой хлопковой салфеткой. Стеклянные пластинки меньшего размера начинают мыть сначала смесью КОН/метанол, а далее так же, как и большие. 2. Вырезать пластинки (Ое)Ьопдо) по размеру больших стекол, не удаляя покрывающую ее бума>у. 3. Около 0,5 мл ДИВ налить на одну из поверхностей большого стекла и накрыть стекло выре- 151 занной пластинкой гидрофобной стороной к стеклу.
Выявление гндрофобной стороны пластинки осуществляется нанесением на нее капли воды: на гидрофобной стороне вода не растекается. Тщателы и разгладить пластинку на поверхности стекла (не допускать образования воздушных пузырей) и после этого удалить бумагу. Высушить пластинку с помощью этанола и чистой хлопковой салфетки.
Обдуть поверхность подсушенной пластинки струей чистого воздуха. Обдуть поверхность второго (меньщего) стекла. 4. Отмыть 96%-м этанолом пластиковые термоустойчивыс полоски, определяющие толщину геля (Брасега). Нанести пальцем (в перчатке) вазелин на край стекла покрытого пластинкой Ое!Ьопбе.
Ширина вазелиновой полоски -! см. Положить на вазелиновый слой спейсеры, покрыть их сверху вазелином и положить лгеньщее стекло стороной, промытой КОН в этаноле, внутрь. 5. Поместить «сэндвич» из стекол в специальный держатель, компонент ДГГЭ-прибора. Закрутить равномерно зажимы держателя. Все края должны быть идеально ровными и пластинка нигде не дщгжна выступать. Замазать вазелином отверстие между стеклами и нижней частью «сэндвича». Г!ромазать аккуратно вазелином боковые стороны «сэндвича» (там, где вставлены спейсеры).
6. Промазать вазелином нижнюю пластиковую полоску, лежащую в специальном штативе, па которую устанавливают «сэндвич» из стекол, и установить стекла, зажатые в держателе, в этот штатив. Несколько ослабить зажимы держателя и с помощью специальной пластинки (она прилагается к прибору), вставляя ее между стеклами, проверить пространство. Прн этом нельзя касаться вазелина, который может выступать сбоку, а особенно на дне «сэндвича» из стекол.
Зажать зажимы. Если «сэндвич» из стекол окажется не герметичным, то, при заливании в него геля, последний будет просто вытекать. 7. Штатив с «сэндвичем» из стекол должен быть установлен на строго горизонтальной поверхноспг. При необходимости приготовить два таких «сэндвича» из стекол. Приготовление пластинок геля с денатурирующнм градиентом.
8. Разморозить одну пробирку с АПС. 9. Вставить в шланг для подачи геля из двухкамерного стакана новую иглу. Открыть отверстие, соединяющее камеры стакана, открутив зажим. Промыть обе камеры ДИВ, откачивая ДИВ с помощью перистальтического насоса при скорости ! ! 0 мл/мин. Высушить систему, продувая сжатым (чисгяым!) воздухом. Закрыть отверстие, соединяющее камеры стакана. 10. Приготовить растворы, содержащие 45%-й раствор мочсвина-формамид (низкая концентрация, НК), 60%-й раствор мочевинаформамид (высокая концентрация„ВК) н «закрепитель» геля согласно прописи в табл.
10.! в 50 мл пластиковых пробирках (подписанных!). 11. Добавить АПС и ТЕМЕД к низкой и к высокой концентрациям смесей мочевина-формамид (МФ) согласно табл. 10.! н немедленно приступить к выполнению операций (5 — 8). 13. Перелить раствор МФ высокой концентрации в правую часть двухкамерного стакана„низкой концентрации — в левую. Включить магнитную мешалку. Иглу, соединенную со шлангом, отходящим от двухкамерного стакана и проходящим через перистальтический насос„ опустить между стеклами «сэндвича».
13. Открыть отверстие, соединяющее камеры ста- Таблица !О.! Порядок смешивания растворов для получения денатурирующею градиента в ~олиакрнламидном геле 152 Таблица 10.2 Схема приготовления образцов для загрузки в гель с денатурирующвм градиентом кана, открутив зажим, и немедленно включить перистальтический насос со скоростью 4,0 мл/мин. Внимательно контролировать процесс заполнения пространства между стеклами смесью растворов. Проверитьь неги ли утечки растворов.
'14. Перекачивание геля занимает 10 мин. Как только растворы будут полностью перекачены между стеклами, сразу жс тшательно промыть двухкамерный стакан и трубку ДИВ, перекачивая воду тем же насосом, но со скоростью !О мл/мин, и высушить сжатым воздухом. После этого иглу заменить новой.
15. Тщательно вымытую, в том числе 9696-м этанолом, и потом высушенную «гребенку», создающую 16 карманов (в которые будут вноситься продукты ПЦР), вставить в пространство между стеклами, которое к этому времени должно быть почти полностью заполненно гелем. 16. Внести 10%-й АПС и ТЕМЕД в закрепи- тель. Быстро набрать этот раствор в шприц объемом 10 мл, насадив при этом новую иглу, и нанести его на поверхность еще не застывшего геля между стеклами под «гребенку», так чтобы гель едва выступал над низким стеклом.
Не допускать образования воздушных пузырей как на предыдушем, так и на данном этапе. Тщательно промьпь шприц дистиллированной водой. 17. Оставить гель на! ч для полимеризации. Электрофорез ДНК в денатурирующем градиенте геля. 18. Залить свежеприготовленный 0,5 к ТАЕ буфер в «ванну» ДГГЭ-машины до отметки «Ей!» (7 л). 19. Установить верхнюю часть ДГГЭ-машины, содержащую блок подключения к электропитанию и зр., на «ванну» с буфером и включить прибор (ОСос!е™, США) по крайней мере за 60 иин до начала электрофореза, с тем побы буфер успел нагреться до 60 С. Металку пвд «ванной» и переиетиватщийнасос пака не вкл«вчить! 20.
После часа полимеризации геля осторожно удалить «гребенку». Вынуть из штатива держатель с затвердевшим гелем между стеклами. Отмыть горячей водой остатки вазелина с поверхностей. Промыть «карманы» в геле 0,5 к ТАЕ буфером с помощью шприца. 21. Отключить ДГГЭ-машину, подождать 1 мин, снять верхнюю часть прибора. Поместить «сэндвич» из стекол с гелем в держатель, находящийся в «ванне» ДГГЭ-машины с горячим буфером. Оба держателя в «ванне» прибора должны быть заполнены «сэндвичами» с гелем или без (холостой вариант). Установить верхнюю часть прибора, содержащую блок подключения к электропитанию, на «ванну» и подсоединить к блоку управления электропитанием.
22. Включить ДГГЭ-машину, вкшочить верхнюю мешалку и мешалку, находящуюся под «ванной» машины (300 об/мин). Оставить в таком состоянии на период подготовки образцов. 23. Подготовить исследуемые образцы ДНК согласно табл. !0.2. Выключить прибор. Выждать 1 мин. Снять верхнюю часть.
Внести исследуемые образцы в «карманы» гелевых пластинок. Если образцов много и их вносят во все «карманы» обоих «сэндвичей», то последовательность заполнения карманов второ~о геля осуществляют в зеркальном порядке относительно первого геля.
Не использовать «карманы» 1, 2 и 15, 16. Для внесения образцов ДНК в «карманы» используют не традиционные, а специальные наконечники с удлиненными носиками. Возвратить верхнюю часть прибора ца место. 24. Произвести настройку (при необходимости) программы блока питания (16 ч, напряжение 100 В) и самого ДГГЭ-прибора и включить его.
Система надежно работает в течение заданного времени и автоматически отключится по его истечении. 153 Т а б л и ц а 10.3 Последовательность операций при окрашввании гелей Номер операции Время обработки, мии' Раствор Фиксирование 30 30 То же Окислитель(г = 23 — 25 С) 10 4 ДИВ 10 Повторить операцию 4 не менее 9 раз, до тех пор пока исчезнет желтоватый цвет геля! Серебрение (г = 23 — 25 'С) 30 6 ДИВ То же гдо 45' С Раствор проявителя должен быть подогре Проявитель То же Стоп-распюр 1О 1О То же Консервируюший раствор 13 Не менее 1 ч 154 * Все операции вынолгшются при слабом покачивании на качалке (Не!г!о1рЫЛшпах), 50 об/мин.
Операции 8 — 10 и операции 11 и 12 — при 90 об/мин. При проявлении гелей лотки должны быть накрыты. "" В некоторых случаях эта операция не нужна, если окрашиваются ПЦР-продукты, полученные нз чистых культур. В некоторых случаях операции 9 и 10 в сумме занимают 15 мин, если ПЦР-продукты были получены после экстры ировання ДНК из почвы и т.д. Окрашивание электрофореграммы для выявления полос ДНК.
1. Выключить прибор. Снять верхнюю часть прибора, изъять оба «сэндвичал с гелем из «ванны». Ополоснуть ДИВ. Промьпь два стеклянных лотка (20 к 20 см) не менее 20 мин 0,1 н. НХОн после ополоснуть ДИВ. 2. Удалить стеклянные пластинки и изьять гель вместе с пластиковой подложкой Ое1Ьопг)~. Провести обрезку геля. Для этого вырезать гель нужной нлирины (примерно 17 к 17 см), отрезав порожки 1, 2 и 15, 16, и обрезать верх и низ (оставив примерно ! 5,5 см). Если было два геля, пометить фронтальный. Ополоснуть гели ДИВ. После обрезки гелевыс пластинки должны легко вмещаться и двигаться в стекланных лотках. 3. Приготовить окислитель, серебряный краситель и проявгггель. Подогреть проявитель до 45 'С.
4. Провести окрашивание геля согласно табл. 10.3. 5. Операции 1 — 7 следует проводить, используя олин лоток для обоих гелей. При этом один гель следует поместить пластиковой подложкой Ое!Ьопг!н ко дну лотка, а другой — подложкой вверх. 6. Для персворачивания и изымания гелей из растворов пользоваться только пинцетами соответствующей формы.
Раствор АХ!л!О, после использования следует собирать, помня, что раствор содержит тяжелый металл. 1. После операции 13 верхнюю часть геля (при этом Ое1Ьопоо подложка находится снизу) покрыть целлофановой пленкой, обрезать ее по размеру геля и поместить гель в сушильный шкаф прн 60 С на сутки. 8. Высушенный гель протереть 9656-лл этанолом, его можно хранить неограниченно долго. Интерпретация результатов ДГГЭ. После злектрофореза продуктов ПЦР получают фореграмму ампликонов в виде горизонтальных полос, по ширине соответствующих ширине зубцов использованной мребенки» и имеющих «толщину», зависящую от концентрации каждого ампликона (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
