А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Следует отметить также, что для описания новых штаммов бактерий изучают, как правило, больше признаков, чем необходимо для их идентификации, так как ключи и таблицы включают не все признаки идентифицируемых бактерий, а только те, которые отличаются у разных видов (табл. 9.1). Глава 10 ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ПРИРОДНЫХ СООБЩЕСТВ БЕЗ ВЫДЕЛЕНИЯ В ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ Методы учета и определения активности микроорганизмов иохимическис и молекулярно-генетические методы; с использованием микроскопии или без микроскопии Генетически модифицированные микроорганизмы Иммуна- химические ярно- сские ()РР 'брала ШХ З, Р!3Н, Рис. ! Од.
Микроскопические и молекулярно-биалогические методы учета и определения активности микроорганизмов без выделения н чистые культуры: АΠ— акрихин оранжевый [асгише огапяе[; ГгАР! — 5-(4,6-дихлортриазип-2-ил) аминофлуоресцеин [5-(4,6мйсмога!пат1пе-2-у1) ааппойаагезсе!п[; ()АР! — 4,6-диамидгпю-2-фенилиндол [4,6- б!юп)Е!по-2-рбепуйпйо1е); Г()А — флуаресцсин диацетат [йоагезсегп Е!асс!а!с); НТС вЂ” флуоресценн пзотиоцианат [йоогезсеш Ио!Гбосуапаге1; ЗР[)А — 5-(и 6-) сульфофлуоресцеин диацетат [5-(апб 6-) за1(ойпогезсе!п б!асс!ага); сгР1' — зеленыи флуоресцирующий белок [йгееп йпогезсеш ргоге!п); Р(ЗН вЂ” йсагссзспсе!п И!и ЬуЬг[б!таг)огц 1ХХ вЂ” белок люцифераза [1ас)(егазе ргогеш) 143 В последнее десятилетие ХХ в.
было разработано довольно много методов для характеристики микробного разнообразия в природных местообитаниях и в первую очередь почвы как наиболее сложной системы методов, основанных на экстрагировании и исследовании ДНК тотального микробного сообщества (Мщхсг апг[ В!па[[а, 1998). Наиболее широко распространенные молекулярно- биологические, а также и микроскопические методы учета и определения активности микроорганизмов без выделения в чистые культуры приведены в сводной таблице (рис.
10.1). (с применением соответствующих праймеров — затравок) в результате полимеразной цепной реакпии (ПЦР). После этого проводится проверка наличия и чистоты продуктов ПЦР электрофоретически в агарозном геле. Полученные ПЦР-продукты — конценР1 Н трироватптая смесь амплифицированных участков НК (ампликоны), принадлежащих разным бактериям, разделяют, например, методом ДГГЭ.
Если на этой стадии ввести соответствующие контроли, то можно провести и предварительную идентификацию исследуемых микроорганизмов. Однако для до- ГГЭ Секеенс полос геля стоверной идентификации, как и для выявления новых организмов, нужно будет провести изьятие (вырезание) отдельных полос (ампликонов) из электрофореграммы геля и определение их нуклеотидных последовательностей (секвенирование). Выявленные последовательности сравнивают — идентифицируют с данными, имеющимися в международном банке генов, после чего составляют списки выявленных микроорганизмов и строят филогенетические схемы микробного сообщества (рис. 10.2).
В качестве дополнительной, но обязательной информации при описании новых мик- Т С О А А С С С Т А С К. Синтез проб грилогенетический анализ 0 Построение дендрогреим 0,1 Рис. 10.2. Схема анализа биоразнообразия микробного сообщества 144 К таким методам относятся: анализ реассоциации ДНК; гибридизация ДНК микробного сообщества; определение профилей процентного состава ГЦ оснований ДНК; сравнительный анализ секвенсов фрагментов рестрикции ДНК; анализ полиморфизма фрагментов рестрикции 16$ рДНК; ресгрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК 16$ рДНК генов; клонирование ДНК-фрагментов, полученных обратной транскрипцией 163 рРНК и клонирование амплифицированных с помощью ПЦР рДНК фрагментов, денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ в английской транскрипции — РООЕ) 16В рДНК ампликонов (Мпухег ег а!., 1998) и некоторые другие.
В результате появилась реальная возможность осуществлять выявление и идентификацию известных бактерий в природных образцах без выделения этих бактерий в чистые культуры, а также выявлять присутствие в исследуемом образце неидснтифицированых (отсутствующих в банке данных, коллекциях), новых организмов. При выполнении таких исследований необходимо проведение ряда последовательных операций. Первая операштя — это разрушение клеток, выделение нуклеиновых кислот (НК) и при необходимости их дополнительная очистка с помощью соответствующих наборов реактивов.
Следующая важнейшая операпия — амплификация исследуемых участков в выделенной смеси НК для увеличения и выравнивания концентрации этих участков роорганизмов используют данные о процентном составе ГЦ-оснований ДНК каждой чистой культуры и степень ДНК вЂ” ДНК гомологии вновь описываемых штаммов и известных или близкородственных из коллекций культур. Однако обе операции правомерны только лишь при работе с чистыми культурами. Каждая из перечисленных выше операций достаточно сложна и ответственна и требует определенных навыков, точного следования прописям соответствующих методик, а самое главное — использования стандартных реактивов и специального оборудования. В зависимости отпоставлснной задачи некоторые операции могут быть исключены, а другие, наоборот, расширены или проведены мнопжратно. В результате таких исследований можно идентифицировать отдельную чистую культуру, а также получить перечень микроорганизмов, выращенных, например, в виде отдельных колоний на агаризованцой среде или, более того, определичь разнообразие микроорганизмов, обитающих в какой-либо эконише (экотопе) без предварительного культивирования.
Существует довольно много и других методов, позволяющих охарактеризовать микробное разнообразие, и в каждом конкретном случае выбор метода должен определяться поставленной задачей. Как и в традиционных микробиологических методах, в молекулярно-биологических методах имеются свои ограничения и условности. Как невозможно выделить на одной среде и в одних условиях в чистые культуры сильно различающиеся по метаболизму бактерии, так и, например, для выявления зубакгерий и архей молекулярно-биологическими методами нужны разные праймеры.
Для изоляции НК рекомендуется использовать минимальное количество образца, например 0,5 г почвы, и, следовательно, выявленное разнообразие будет отражать экотоп размером в 0,5 г. При идентификации микроорганизмов из природных образцов без выделения в чистые культуры предполагается, что после проведения ПЦР получают примерно равное количество ампликонов всех присутствовавших в образце бактерий.
Однако это может быть далеко не так. В результате проведения ПЦР с универсальным праймером получают больше ампликонов тех бактерий, численность которых была больше в исходном образце и НК которых из образца было выделено больше. При разделении продуктов ПЦР-методом ДГГЭ из-за очень низкой концентрации некоторых ампликонов их полосы могут быть трудно различимы на фоне других полос. С другой стороны, высокие концентрации ампликонов близкородственных организмов на недостаточно качественной ДГГЭ-фореграммс могуг выглядеть в виде одной объемной полосьь Помимо этих проблем, легче или труднее, но проверяемых и решаемых, существуют и более трудные зада ш, такие, как спонтанный синтез химерных ампликонов при проведении ПЦР, которые легко могут быть приняты за наличие в образце новых, неидентпфицированных или некультивируемых организмов.
В частности, и из-за этого факта Международным комитетом по систематике и таксономии бактерий было принято решение нс принимать к рассмотрению описание новых микроорганизлюв без вьщелсния чистых культур этих организмов. В результате проведения всех стандартных операций' будут получены данные, отражающие только разнообразие микроорганизмов в исследованном образце по типу «есть — нет», но не количественное присутствие каждого вида.
Формально вид, представленный в образце одной клеткой и миллионом клеток, имеет равные шансы быть представленным в списке. Для преодоления 145 этого существенного неудобства в настоящее время разрабаттяваются методы количественной ПЦР. В одном из них используется внутренний контроль в виде известных концентраций НК. Такис стандартные контрольные образцы подвергаются амплификации наряду с экспериментальными. После прохождения соответствующего количества циклов контрольные и экспериментальные образцы сравниваются, а количество НК и число циклов дают возможность рассчитать исходное количество того или иного микроорганизма. Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков из-за высокой чувствительности конечных этапов ПЦР к разного рода химическим и физическим факторам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
