А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Надежным аплифнкатором, рекомендуемым для работы, является прибор РТС-200 (ИЧА Епя(пе (Огаб(еп! сус!ег) В(Охупь Т!1е !чегиег!апг!з) и соответствующая программа. Последовательность циклов нагревания — охлаждения и их продол»кительность может оыть следующая. Начальную денатурирующую стадию проводят при температуре 94 'С в течение 3 мин; палее в каждом пикле денатурация осуществляется при 94'С в течение 1 мин. Начальный отжиг праймеров происходи~ при температуре 60 С в течение 1 мин и затем температура снижается на ! "С в каждом втором цикле до 55 С (в первых !1 циклах).
В следующих !9 циклах отжиг проводят при 55 *С и также в течение 1 мин. Время «растяжения» (ехгепа!оп) праймеров равно 2 мин при 72'С. Заключительная стадия «растяжения» осуществляется при 72 С в течение 10 мин и затем смесь охлаждается до +4'С. Качество продуктов ПЦР (ампликонов), размер которых при описанных выше условиях будет равен 474 парам нуклеотидов (п. н.), проверяют электрофоретически в стандартном (1%-м) агарозном геле с последующим окрашиванием этидиум бромиэом (рис. ! 0.4).
Продукты ПЦР можно хранить некоторое время при — 20'С. 40.3. ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ГРАДИЕНТНЫЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ (ДГГЭ) И ЕГО ВОЗМОЖНОСТИ Этглм методом проводят разделение фрагментов ДНК одинаковой длины, но различных по составу комплементарных пар нуклеотидов (и. н.). Теоретически метод позволяет разделить ампликоны величиной до 500 п. н., различающиеся всего лишь одной парой нуклеоидов (Муегз ег а1., 1998). Следовательно, этот метод особенно полезен как при сравнении, например, микробных сообществ каких-либо образцов, так и при сравнении исходных вариантов и мутантов чистых культур. В последнем случае ПЦР должна быть проведена с использованием специфического для данной мутации праймера (функциональным праймером). Вместе с тем анализ ДГГЭ методом ПЦР амплифицированных экстрактов ДНК с универсальными праймерами, экстрактов, выделенных пз природных образцов с высокой численностью и разнообразием микроорганизмов (богатые почвы, компосты и др.), позволяет выявить не все разнообразие, а численно доминирующие виды.
Разделение в ДГГЭ основывается на снижении электрофоретической подвижности частично расплавленной двухцепочечной молекулы ДНК (амплико- 149 на) в полиакриламидном геле, содержащем линейно увеличивающийся градиент денатурантов ДНК, которыми являются смесь мочевины и формамида. Плавление фрагментов ДНК обеспечивается в дискретных местах — доменах плавления, полосах пар оснований с идентичной температурой плавления. Когда домен, подверженный плавлению, достигает «своего» места в денатурирующем градиенте геля, спиральная структура ДНК переходит в частично расплавленное (расщепленное) состояние, и движение молекулы практически останавливается.
Описанный подход позволяет разделить до 50% всех вариантов исследуемых последовательностей в фрагментах ДНК длиной до 500 и. н. Процент разделения (чувствительность) может быть увеличен практически до 100 % „если прикрепить к разделяемым путем ДГЭ ДНК-фрагментам «фиксаторы» — нуклеотидные последовательности с высоким содержанием ГЦ-оснований, которые затем будут действовать как высокотемпературные домены плавления. Прикрепление таких последовательностей осуществляется или в процессе клонирования, или при проведении ПЦР, где к синтезируемым ампликонам прикрепляются добавочные нуклеотидные последовательности, размером от 40 до 50 и.
н.„которые в свою очередь были прикреплены к 5'-концу праймера при его синтезе. Таким образом, в методе ДГГЭ задействованы следующие факторы: 1) одинаковый размер (длина) фрагментов ДНК (одинаковое количеспю пар нуклсотидов), например 474 пары, с соответствующими «фиксаторами» на концах, полученными в процессе ПЦР; 2) состав нуклеотидов ампликона; 3) повышенная, но стабильная температура, которая инициирует плавление фрагментов куска ДНК, но из-за разного состава нуклсотидов плавление этих фрагментов ДНК происходит сильнее или слабее; 4) элекгричсское поле, обеспечивающее движение заряженных фрагментов ДНК в геле с определенной скоростью; 5) наличие в геле химических денатурантов, причем эти денатуранты должны образовывать в геле градиент — от очень низкой концентрации в верхней части геля к максимально высокой в нижней части.
Наиболее широко используемый вариант ДГЭ вЂ” это «параллельный» денатурирующий градиент, параллельный вследствие того, что денатурирующий градиент увеличивается в том же направлении, что и направление электрического поля. Ниже приводится про~оков приготовления пластин геля с денатурируюшим градиентом, последовательность внесения пролуктов ПЦР в гель, условия проведения электрофореза, фиксирования, окрашивания и других операций (Ъ'ап Р!ереп1пйеп е! а!., 2003). Согласно этому протоколу, можно будет приготовить денатурируюший градиент в пределах от 45 до 60%, где 100%-й денатурируюший эффект создают 7 М мочевина и 40%-й формамид, а 8%-й акриламид без мочевины и формамида обеспечивает нулевой денатурируюший эффект.
Материалы. Количество посуды и реактивов определяется количеством исследуемых образцов. Перчатки резиновые для работы в лаборатории; пробирки типа Эппенлорф объемом от 0,2 до 1,0 мл; автоматические пипетки с наконечниками и рабочими объемами от 1 мкл до 5 мл; 4 сз.еклянные пластинки, две размером 22,3 к 20 см и две— 20 х 20 см; пластиковые термоустойчивые полоски, определяющие толщину геля (8расегз), толщиной 1 мм; целлофановая пленка размером не менее больших стеклянных пластин (Атсгайат РЬагтас)а Вю!есй АО, урраа!а, Биедеп); «гребенки»; пластиковые прозрачные (упругие) пластинки (Ое!Ьопйо), (АгпегзЬагп Р1заппасга Вю!есЬ, АО, (!ррза!а, 8ведеп, 80-1129-37); шприцы разного обьема с иглами.
150 Оборудование. Магнитные мешалки, разных размеров н мощности; качалка наклонная, вращающаяся с излсеняемойг скоростью вращенги; рН-метр; холодильник; морозильная камера на — 20 С; ДГГЭ-машина (ТЬе Особе ьуз1еш, В1Ойад 1.аЬогасопез, США) л>и проведения электрофореза; блок питания для ДГГЭ-машины; специальный двухкамерный стакан для приготовления и создания градиента; шланги разного диаметра, в частности 1,7 мм (внутренний диаметр); перистальтический насос с точно программируемой скоростью подачи жидкости (Не!до1рЬ РО 5201, ТЬе 19е(Ьет!апдз).
Реактивы и пх подготовка для приготовления геля с деиатуриру>ощим градиентом. Ионообменпая смола АО 501-Х8 (В!о-йас), США) и деионизовинный формамид (Якша, США). Последний готовят добавлением 12,5 г ионообменной смолы к 250 мл (100%- го) формамнда. Перемешивают смесь прн комнатной температуре в течение часа.
Пропускают раствор через фильтровальную бумагу, избегая попадания слюлы. Хранят в темноте при температуре 4 — 6'С. Раствор КОН в ме>паноле (5%-й) лля очистки стекол, используемых для приготовления геля. Мочевини-форл>амид (МФ), 45%-й раствор в 6%-м растворе акриламнда-бисакриламида.
Готовят смешиванием 47,3 г мочевины (Вю-рсад, США); 37,5 мл 40%-го акрнламида-бисакриламида (37,5: 1, В!о-йас1, США); 45 мл леионизованного формамида; 2,5 мл 50 х ТАЕ (триг-ЭДТА) буфера (В1о-Гсас1, США); 250 стерильной деионизованной воды (ДИВ). Раствор можно хранить а темной стеклянной посуде до 6 мес при 4 С. Мо >евина-формамид, 60%-й раствор в 6%-м растворе акриламида-бисакрнламида. Готовят добавлением 63,0 г мочевины, 37,5 мл 40%-го акриламида-бисакриламида (37,5: 1), 60 мл деионнзованного формамида, 2,5 мл 50 х ТАЕ буфера, 250 стерильной ДИВ.
Раствор можно хранить в темной стеклянной посуде до 6 мес прн 4 С. Мочевина-форл>амид, 0%-й раствор в 8%-м растворе акрилалпсда-бисакриламида. Готовят добавлениел> 40 мл 40%-го акриламида-бнсакриламида (37,5: 1); 2,0 мл 50 х ТАЕ буфера; 200 стерильной ДИВ. Раствор можно хранить в темной стеклянной посуде до 6 мес цри 4 С. Нерсульфат аммония (АПС, Вю-Вас), США) готовят в виде 10%-го раствора (вес/объем) в стерильной ДИВ. Разливают по 400 мкл в 1,0— 0,5 мл пробирки (Эппендорф) н хранят при — 20 С, каждый раз используя новую пробирку. Реактивы и пх подготовка для окрашивания нуклеиновых кислот в геле азотнокислым серебром после фореза. Набор (1й>) включает реагенты: азотнокислое серебро (ВюГсас), США), окислитель и проявитель. Приведенного ниже количества достаточно для обработки двух пластин геля.
Хранить набор нужно в холодильнике. Раствор для фиксирования геля готовят смешиванием (объем/объем) !0%-го этанола и 5%-й уксусной кислоты. Для фиксирования одного геля требуется 400 мл. Для приготовления раствора используют ДИВ. Окислителыотовят растворением 15 мл (10-кратно концентрированного) реагента нз упомянутого выше набора (В!о->сясь, США) в 150 мл деиопизованной воды. Каждыйраз необходимо готовить свежий раствор1 Серебряныи краситель (на основе азотнокислого серебра) готовят растворением 15 мл (10-кратно концентрированного) реагента из упомянутого выше набора (В)о-)(аб, США) в ! 50 мл ДИВ.
Казкдый раз готовится свежийраствор! Проявитель готовят растворением 16 г проявитшш, взятого из набора (В1о-йад, США), в 500 мл ДИВ. Хранит прн 4 'С. Огтанавлива>агний реакцию нроявления раствор состоит из 5% го раствора уксусной кислоты в ДИВ. Конгервируюисий риствор для геля состоит из смеси 25% этанола (объем/объем) и 10% (обьем/объем) глицерола. Раствор может быть использован многократно. Загрузочнь>й буфер (ЗБ) состоит нз 1,5 мл глицерола и 12„5 мг бромфенол голубого (БФГ) в 5 мл ДИВ. Подготовка материалов и оборудования. 1. Тщательно вымьпь большие стеклянные пластинки с моющим средством и мягкой (не >Сарана>ои>ей стекло!) губкой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
