А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Поэтому концентрацию различных по составу белков определяют лишь количественно до некоторой степени. К преимуществам метода можно отнести быстроту определения (1О мин) и высокую чувствительносттч к недостаткам — варьирование результатов при определении концентраций различных белков и необратимое денатурирование порции белка, пошедшей на определение. 168 Определение проводят с помощью спектрофотометра или ФЭК (длина волны максимума поглощения 595 нм). Для работы потребуются кюветы (можно пластиковые), пипетки, пробирки, штатив для пробирок. В качестве стандарта применяют бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) или яичный альбумин, который дает более точные результаты. Сгландиртный исходный раствор содержит 350 мг краски (Бегга В1ие О или Впрйапг В1ие В, К!8гпа); 100 мл 95%-го этанола и 200 мл 85%-й ортофосфорной кислоты.
Данный раствор стабилен при комнатной температуре. Рибоыий раствор состоит из 30 мл стандартного раствора; 15 мл 95%-го этаиола, 30 мл 85%-й ортофосфорной кислоты и 425 мл дистиллированной воды. Рабочий раствор пропускается через фильтр М 1 (1в)заппап). Он хранится при комнатной температуре в затемненной бутыли в течение нескольких недель с периодическим фильтрованием. Процедура определения. В пробу белка (100 мкл максимум) добавляют буфер до 100 мкл (если требуется) и 1 мл рабочего раствора краски, перемешивают и после 2 мин инкубации определяют оптическую плотность раствора при 595 нм (Агм). Оптическая плотность может измениться через 1 ч с момента добавления краски. Стандартную кривую строят по растворам яичного альбумина (нли бычьего сывороточного) с содержанием белка от 2 до 20 мкг/100 мкл пробы (20— 200 мкг/мл).
Значения оптической плотности в этом случае должны быть в пределах 0,1--0„7 ед.прн 595 нм. 12.1.3. Определение белка по методу Лоури Данный метод был предложен Лоури с совет. в 1951 г. и с тех пор широко используется в лабораторной практике. К преимуществам метода относятся универсальность и точность, к недостаткам — отрицательное влияние на точность измерения многих соединений (однако этот недостаток может быть преодолен осаждением белка из раствора перед определением), медленное развитие цветной реакции, нестабильность некоторых реактивов, а также необратимая денатурация порции белка, пошедшей на определение. Чувствительность метода от 5 до 100 мкг белка/мл.
Определение проводят с помощью спектрофотометра или ФЭК (длина волны максимума поглощения 750 нм). Для работы потребуются кюветы (можно пластиковые), пипетки, пробирки, штатив для пробирок. В качестве стандарта можно применять бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл), однако яичный альбумин дает более точные результаты.
Ниже приведена современная модификация метода. Для определения готовят рабочие растворы реактивов А, В, С и О. Расглвор А содержит 0,5 г САВО„. 5Н,О и 1 г ХазСвнз07 2Н,О (цитрат натрия) на 100 мл дистиллированной воды. Раствор З: 20 г Ха2СОз и 4 г ХаОН в 1 л дистиллированной воды. Растворы А и В устойчивы при комнатной температуре. Раствор С: 50 мл раствора В и 1 мл раствора А (готовят перед определением).
Раствор В: разведенный в 2 раза дистиллированной водой перед определением реактив Фолина (приготовление реактива Ослина см. в приложении 5). Процедура определения. Смешивают 0,5 мл пробы белка и 2,5 мл раствора С. После перемешивания и инкубапии при комнатной температуре 5 — 10 мин добавляют 0,25 мл раствора О, перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 20 — 30 мин и измеряют оптическую плотность раствора при 750 нм. Проба белка может быть отделена от мешающих определению веществ осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Этим же способом можно пользоваться при определении белка в сильно разбавленных растворах (менее 1 мкг/мл).
Для осаждения к пробе 169 белка в 1 мл добавляют 0,1 мл 0,15%-го раствора дезоксихолата натрия (ДХН), перемешивают и выдерживают при комнатной температуре !О мин. К смеси добавляют 0,1 мл 72%-й ТХУ, перемешивают и выпавший осадок отделяют центрифугированием при! — 3 тыс. я в течение 5 — 30 мин. При использовании угловых роторов, при низких температурах или больших объемах время осаждения увеличивают. После осаждения надосадочную жидкость сливают и отбрасывают, осадок перерастворяют в реактиве С.
Метод Лоури применим также для определения белка в гидролизатах клеток микроорганизмов. Для гидролиза берут 2 М КОН и ведут гидролиз при 37 *С в течение 2 ч, в течение ночи при комнатной температуре или 10 мин на юшящей водяной бане. Время развития цветной реакции обычно не превышает 20 — 30 мин после добавления раствора Р, затем оптическая гшотность уменьшается примерно на 1 % в час.
Большинство мешаюн!их определению веществ снижает развитие окраски, однако некоторые детергенты могут, напротив, ее усилить. 12.2. АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Анализ нуклеиновых кислот получил широкое распространение при их идентификации в систематике прокариот, поскольку вся или основная генетическая информация заключена в одной молекуле ДНК. Это позволяет изучать ее, не опасаясь загрязнения другими ДНК вЂ” митохондриальной, хлоропластной, как может быть в случае эукариотных организмов.
Геномы различных бактерий сравнивают по их размерам, общему содержанию оснований ДНК 1молярная доля гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК, %1 по последовательностям нуклеотидов рибосомных РНК и степени гибридизации нуклеиновых кислот. Для разных прокариот установлены границы молярного содержания ГЦ в ДНК от 23 до 75%.
Значение ГЦ постоянно для данного микроорганизма. Если по этой характеристике ппаммы отличаются значительно (более чем на 10%), то это свидетельствует, что они относятся к разным родам. Однако близкие значения П1 в ДНК не обязательно говорят о филогенетическом родстве, поскольку организмы могут существенно различаться по последовательностям нуклеотидов в ДНК.
В связи с этим более важным является сравнение гомологии участков ДНК или РНК изучаемых видов. Достаточно просты и доступны методы гибридизации сравниваемых ДНК вЂ” рРНК, которые проводят после их выделения и очистки. 12.2 1. Выделение и очистка ДНК Для выделения нуклеиновых кислот обычно применяют мягкие методы разрушения клеток, включающие использование детергентов и лнзоцима, хотя для разрушения некоторых микроорганизмов с прочными клеточными стенками могут понадобиться пресс, стеклянные бусы или растирание клеток с абразивами (см.
13.1). В некоторых случаях для «ослабления» клеточных стенок в раступ!ие культуры (например, грамположительных бактерий) добавляют глицин, лизин или треонин. Иногда для тех же целей клетки грамположительных бактерий в растущих культурах обрабатывают антибиотиками„такими, как пенициллин С или метициллин, которые подавляют биосинтез пептидоглика- !70 на клеточной стенки. Чувствительность к лизоциму микобактерий, содержащих высокий процент липидов и полисахаридов в клеточной стенке, может оыть усилена их обработкой изопропанолом. При лизисе микроорганизмов, имеющих особенно прочные клеточные стенки, применяют поли(этиленгликоль) с последующим удалением из лизата, так как его присутствие мешает проведению дальнейшей очистки ДНК.
Очистку ДНК из разрушенных клеток ведут последовательным отделением от белков обычно с использованием смесей хлороформ — изоамиловый спирт или фенол — хлороформ и многократным переосаждением ДНК этанолом. От следов РНК препараты ДНК освобождают с помощью РНКазы, а от следов белка — с помощью протеаз.
ДНК сушат под вакуумом и хранят при 4 С. 12.2.2. Определение нуклеотидного состава ДНК Для определения молярного содержания ГЦ (%) в ДНК чаще всего применяют два метода: один основан на измерении плавучей плотности, другой— на анализе кривых температуры плавления (Т,„) выделенных ДНК. В качестве стандарта в обоих случаях применяют ДНК известного состава, выделенную тем же методом. Оба метода быстрые и дешевые. Более точным является метод фракционирования ДНК на основания и количественное определение каждого нуклеотида в отдельности с использованием хроматографии на бумаге. Однако этот метод более длителен, трудоемок, и для получения воспроизводимых результатов необходима тщательная очистка препарата ДНК от РНК.
Различия в спектрах поглощения очищенных ДНК могуг быть использованы также при определении их состава в сравнении с препаратом ДНК известного процентного содержания ГЦ. Этот метод даст быстрое и точное определение. Он считается удобной альтернативой, если оборудование для определения плавучей плотности или термальной денатурации ДНК недоступно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
