А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Как правило, время лизиса не превышает 15 — 30 мнн. Рассмотрим этот метод на примере Езслег/сЬ/а сой. Для лизировання клетки суспендируют в ТЕ-буфере (50 мМ трио-НС1, рН 8,0 н 10 мМ ЭДТА) из расчета 3 мл буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают до 37 С. Добавляют 1 мл раствора лнзоцнма (свсжепрнготовленный раствор в ТГ-буфере, 10 мг/мл) на каждые 5 мл суспензия илн эквивалентное количество сухого лнзоцнма н ннкубируют 10 — 20 мин прн 37 С с легким покачиванием. Быстрее клетки лизнруются прн повышении действующей концентрации лнзоцима до 10 мг/мл. В таких условиях удовлетворительного лнзиса можно достичь в течение 5 мин даже прн 4 С.
Для получения сфсропластов дрожжей суспензия нх клеток могут быть подвергнуты лизнсу с помощью препарата ферментов, выделенных из содержимого желудка виноградной улитки. Такой «улиточный фермент» в течение короткого времени прн 37 — 40 Слнзирует, например, клеточную стенку дрож- 181 жей рода Юасслаготусек Препарат фермента готовят в лаборатории из свеже- собранных улиток и хранят в замороженном состоянии, используя по потребности.
Лизис клеток с помощью детергентов. Этот наиболее мягкий и быстрый способ разрушения клеток по сравнению с другими методами (занимает от 20 до 90 мин) применим лишь для микроорганизмов, лишенных клеточной стенки. Перед лизисом клетки промывают несколько раз забуфсренным соловым раствором (например, !О мМ трис-НС1, рН 7,5, с 150 мМ )л(аС1). После последнего центрифугирования биомассу суспендируют ло плотности 107 — 10' кл/мл или 3 — 4 мг сухих клеток па 1 мл в том же буфере, с добавлением 0,1 — 0,3 % тритона Х-100. Содержимое перемешивают и инкубируют на льду от 1О до 90 мин. Для стабилизации белков в экстракт добавляют 0,2 объема 50%-го глицерола.
Вместо тритона Х-100 могут быть использованы и другие неионные дстергенты. Лизис клеток в присутствии органических растворителей. Лизирование клеток органическил1и растворителями обычно применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах в целях проведения реакций с антителами или гибридизаций с пробал1и нуклеиновых кислот. Для проведения такой обработки чаще всего используют невысокис концентрации толуола (0,1 — 1,0%) в соответствующем буфере. Лизис с помощью замораживания — оттаивания. Этот метод (многократное зал1ораживание, например в ванне с жидким азотом, и оттаивание, например в теплой воде) быстрый, удобный и относительно дешевый.
Он позволяет обрабатывать одновременно большое количество биомассь1 и дает легко воспроизводимые результаты, однако имеет свои ограничения. Клетки, разрушаемые таким образом, должны обладать не очень прочной стенкой или не содержать ее, а интересуемые внутриклеточные компоненты должны быть относительно стабильны к подобного рода обработке, не подвержены денатурации и защищены от протеолиза. 13.1.2. Методы дезинтеграции В болыпинстве экспериментов для выделения и определения внутриклеточных компонентов применяют различные методы разрушения микроорганизмов. Это могуг быть ручные и механические гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание замороженных клеток, персмешивание биомассы со стеклянными бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае применения декомпрсссионных методов (Х-пресс, Френч-пресс) или ультразвука.
Реже применяют осмотический шок и метод замораживания — оттаивания. Описаны также комбинированные методы разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных стенок ферментами с последующим осмотическим шоком полученных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогенизаторе. Перед разрушением клетки необходимо отделить от среды выращивания. В зависимости от вида л1икроорганизма применяют различныс способы отделения, такие, как использование сепараторов для крупных микроорганизмов, осаждсние их фильтрованием через ткань (грибной мицелий) н применение различного рода центрифуг, позволяющих осаждать клетки с охлаждением н без него. В зависимости от величины объектов, целей эксперимента и термолабильности выделяемых структур применяют низко- или высокоскоростное центрифугирование в периодическом илн непрерывном режимах.
Для крупных и тяжелых клеток бывает достаточным короткое осаждение нри 2 — 3 чъ1с. я, тогда как мелкие и легкие клетки требуют длительного цснтрифугирования при 15 — 20 тыс. я. Необходимо учитывать возможный нагрев биологического материала при высокоскоростном центрифугировании объектов без соответствующего охлаждения. Отделенную от культуральнай жидкости биомассу 2 — 3 раза промывают для удаления следов продуктов метаболизма, суспендируя каждый раз в свежей среде (обычно без источника углерода) или в буферном растворе.
Экстракт, полученный после разрушения клеток, отделяют от неразрушенных клеток и крупных обломков центрифугированием с охлаждением в течение от 10 мнн при 15 тыс. я до 1 ч при 40 тыс. я (в зависимости от целей эксперимента). Супернатант, называемый грубым, нли исходным экстрактом, можно затем повторно цензрифугировать при 150 — 200 тыс. х в течение 1,5 — 2 ч для получена прозрачного экстракта клеток н осадка клеточных мембран.
Если при этом исходный экстракт содержит плаваюшие на поверхности частицы, их можно удалить фильтрованием через ткань или стеклянную вату. Для полного разрушения клеток применяют обработку ультразвуком, разрушение на механических мельницах со стеклянными бусами, разрушение на гидравлическом прессе, механическое растирание замороженных в жидком азоте клеток с кварцевым песком в керамической ступке. Ниже приводится описание нескольких способов, которые будут применяться на практикуме. Гомогенизация. Этот способ можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки или для животных и некоторых растительных клеток.
Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3 — 5 обьсмов), переносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10 — 20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с быстро вращающимися ножами (блендеров) время обработки обычно не превышает 1 — 2 мин интервалами по 20 с с промежуточным охлаждением биомассы на льду. Зазор между стеклянной стенкой и тефлоповым пестиком ручного гомогенизатора должен быть в пределах 0,35 — 70 мм.
Механический гомогенизатор можно охлаждать в воде со льдом лля поддержания низкой температуры при разрушении клеток (в этом случае резко снижается активность внугриклеточных протеиназ) или проводить эксперимент в холодной комнате. Степень разрушения контролируют фазово-контраспюй микроскопией или по белку, выевобожденному из клеток. Растирание клеток. Одним из простых, но достаточно надежных способов разрушения клеток микроорганизмов является растирание их суспензий с абразивами. Для этой цели применяют промытый кварцевый песок, тол юное кварцевое стекло, пудру окиси алюминия или другие твердые вещества. При разрушении к клеточной пасте постепенно добавляют двойное количество (по массе) абразива и растирают с силой до появления шелкаюших звуков (обычно 1Π— 15 мин после добавления последней порции абразива). В процессе растирания клеточная паста подвергается нагреву, поэтому дно ступки следует охлаждать (на лотке со льдом).
Особо следует отметить способ растирания клеток микроорганизмов, замороженных в жидком азоте, где в качестве разрушающего абразива выступают кристаллики льда, образовавшиеся при быстром замораживании биомассы (вкалывание суспензии в буфере в толстостенную ступку с налитым жидким азотом). Дзи растирания применяют обычно фарфоровые ступки и пестики.
Время обработки зависит от толщины клеточных стенок разрушаемого микроорганизма. Этими способами можно растирать до 30 г сырых клеток за один прием. После растираний к полученной массе добавляют равный обьем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, неразрушенных клеток и их крупных обломков. Разрушение со стеклянными бусами. Данный метод можно применять даже для разрушения клеточных стенок дрожжей, у которых она очень прочная, поскольку он основан на механи блеском растирании клеток, попадающих между двумя мелкими стеклянными шариками, вращающимися с большой скоростыов механических мельницах. Малые порции биомассы можно разрушать и в пробирке, используя пробирочный смеситель («вортекс»).
Для больших порций клеток необходимо применять специальные механические смеситсли («мельнппыь). Отмытые клетки ресуспендируют в равноги объеме буфсра и помещают в прочную центрифужную пробирку с навинчивающейся пробкой для предотвращения вытекания жидкости при встряхивании. В пробирку добавляют 1 — 3 г охлажденных стеклянных шариков на каждый грамм клето чной массы и встряхивают на смесителе с максимальной скоростью 3 — 5 раз в течение 1 мин. В интервалах суспензию охлаждают на льду. Для микроколичсств применяют пробирки Эппендорф. Стеклянные шарики перед ошпом отмывают концентрированной соляной кислогой (или хромовой смесью), водопроводной, а затем дистиллированной водой ло нейтральной реакции и высушивают в сушгшьном шкафу. К недостаткам метода относягся сильный разогрев содержимого при встряхивании.
13.1.3. Ультразвуковой дезинтегратор и обработка клеток ультразвуком Разрушение клеток ультразвуковым методом происходит в результате мнкроколебаний суспензни бактерий нлн других микроорганизмов, помещенных в стеклянный стакан с излучателем ультразвуковых волн. Ультразвук создает высокую степень вибрации суспензии, вследствие чего происходит механический разрыв клеток. Для достижения максимального эффекта необходимо применять высокую мощность излучателя и тщательно настраивать его в резонанс с пробой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
