А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Субстрат (л-НФП) растворяют в смеси, состошцей из ацетоннтрила, изопропанола и 50 мМ гадис-НС! буфера (рН 8,0) в объемном соотношении 1: 4: 95, до конечной концентрации 100 мкМ. Реакционная смесь (1 мл) содержзгг 985 мкл субстратной смеси, !0 мкл 0,5 М СаС1т и 5 мкл липазы в концентрации 0,2 мкг/ыкл. За единицу активности принимают количество фермента, необходимое для образования ! мкмоля в-ннтрофенолв в минугу при указанных условиях реакции. Липазную активность можно также определить, тнтруя щелочью свободныс жирные кислоты, образующиеся из оливкового масла в результате действия фермента.
Реакционную смесь, содержащую 0,5 мл оливкового масла, 5 мл ацетатного буфера ,'рН 5,6), !О мМ СаС1з и 50 — 100 мкл раствора фермента, инкубируют прп 30'С в течение 30 мин на магнитной мешалке. Реакцию останавливают добавлением 20 мл эганола. Количество образовавшихся жирных кислот определяют тптрованнем 0,1 н. КОН с индикатором фенолфталеином. Контролем служит проба с прокипяченным раствором фермента. Результаты титрования контроля вычитают из данных опьпных проб.
Активность липазы выражают в миллилитрах 0,1 н. КОН. За единицу липазной активности принимают количество 0,1 н. щелочи, пошедшей на титрование 1 мкмоля жирных кислот, образующихся за 1 мин. !87 13.2.2. Инвертаза Инвертаза 1В-фруктофуранозидаза, НЧ> 3.2.1.26) катализирует гидролиз дисахарида сахарозы на два мономсра — глюкозу и фруктозу. Инвертаза действует и на трисахарид раффинозу, при этом образуется молекула фруктозы и молекула дисахарида мелибиозы.
Фермент гидролизует 13-фрукгофураназидные остатки в !3-фруктофуранозидах с нередуцирующего конца. Причем мальтаза (сс-.0-глюкозидаза), отщепляющая терминальные остатки глюкозы, тоже может катализировать эту реакцию. При определении фермента следует учитывать, что сахароза достаточно легко гидролизуется и неферментативным путем при кислой реакции среды. Инвертаза широко распространена среди различных групп микроорганизмов, причем многие культуры имеют более одной формы фермента: внеклеточный и внутриклеточный.
Инвертаза обладает достаточно высокой активностью в широком диапазоне рН (3,5 — 5,5) с оптимумом активности цри рН 4,5; температурный оптимум фермента находится около 55 'С. Выделение. Дромгжи, пленку плесени или бактериальную массу обезвоживают сущкой при 40 С нли волоотнимающимн реактивами. Сухой препарат растирают в ступке с трехкратным количеством кварцевого песка иля стеклянных бус, прибавляют десятикратное количество воды, несколько капель толуола н оставляют при 35 'С на 2 ч. После этого смесь Фильтруют через бумажный фильтр и прозрачный фнльтрат употребляют в качестве препарата инвертазы.
Альтернативно получают бесклеточньгй экстракт любым из приведенных в гл. 15 методов и используют его в качестве источника фермента. Определение. В пробирку наливают 3 мл раствора Фермегпв в 100 лгМ ацетатном буфере (рН 4,5) и инкубируют в течение 5 мин на водяной бане при желаелюгг температуре (23 — 40 'С). Затем прибавляют 3 мл предварительно подогретого ло той же температуры 5%-го раствора сахарозы и оставляют на 5 мнн. По окончании экспозиции гидролиз сахаровы останавливают прибавлением 6 мл щелочного реагента на основе линитросалицяловой кислоты !ЦНСК). Контрольную пробу ставят с прокипяченным раствором Фермента. Количество редуцирующих сахаров определяют колориметрическим методом с ДНСК-реагентолг. С этой целью пробирки янкубируют в течение ! 0 мин на водяной бане при 95 'С для развития характерной красно-коричневой окраски, охлаждают реакционную смесь и измеряют поглощение при 540 нм.
Количество пгдролизоввнной сахаровы определяют по калибровочной кривой, построенной на основании поглощения эквимолярного раствора глюкозы и фруктозы. За единицу инвертазной активности принимают такое количество фермента, которое гилролизует ! мкмоль сахарозы в ! мин при рН 4,5 н температуре реакции. ДНСК-реагент готовят, смешивая в ! л !О г 3,5-динитросалициловой кислоты, !6 г 1заОН и 300 г К-1за-тартрата тетрагидрата. 13.2.3.
Амилаза Амилаза — фермент, катализиручощий гидролиз крахмала и гликогена. Растительный крахмал состоит из двух полимеров — амилозы (15 — 25%) и амилопектина. Амилоза представляет собой линейную цепь из остатков .0-глгокозы, связанных 1,4-а-связялги. Амилопектин — это тоже поли-1,4-гг-Ю-глюкоза, по его молекула сильно разветвлена благодаря наличию 1,6-гг-связей. Амилоза малорастворима в воде и окрашивается при взаимодействии с йодом в синий 188 цвет.
Амилопектин, напротив, растворяется в горячей воде с набуханием„обра- зуя крахмальный клейстер, а йодом окрашивается в коричневый цвет. а-Амилаза (1,4-а-Л-глюканглюканогидролаза, НФ 3.2.1.1) расщепляет крахмал по эндотипу, пшролизуя 1,4-и-связи в амилозе и амилопектине во всех частях молекулы.
Это приводит к быстрому снижению вязкости раствора крахмала и его способности окрашиваться йодом в синий цвет. Гидролиз крахмала сопровождается образованием низкомолекулярных олигосахаридов, а-декстринов, ограниченных 1,б-а-связями, а также мальтозы и глюкозы. б-Амилаза (1,4-а-21-глюканьгальтоггшролаза, НФ 3.2.1.2) расщепляет крахмал по экзотипу: гидролизует 1,4-и-связи через одну с нередуцирующих концов цепей, образуя мальтозу с редуцируюшсй группой без промежуточных продуктов, а также высокомолекулярные декстрины, ограниченные б-связями.
При воздействии б-амилазы крахмал долгое время сохраняет способность окрашиваться йодом. 0-Амилаза разрушается при нагревании до 70 С в течение 15 мин, а термостабильная и-амилаза почти не снижает своей активности при этой температуре, зато теряет активность при кратковременном снижении рН среды до 3,3. Этим пользуются для раздельного определения амилаз при их совместном присутствии. а-Амилаза широко распространена у плесневых грибов (Азрегя111пг), бактерии же образуют амилазы обоих типов (Вап11из). Активность а-амилазы определяют методом йодной пробы, а также вискозометрически по скорости разжижения крахмального клейстера. З-Амилазу, как и суммарное действие обоих ферментов, определяют по количеству образовавшейся мальтозы.
Определение. Активность а-амилазы измеряют по методу Смита и Роя в модификапии Маннинг и Кемпбелла. Метод основан на фотометрическом определении скорости изменения окраски крахмала с йодом под действием фермента. Реакционная смесь (1 мл) содержит 50 мМ Ха-ацегатный буфер (рН 5,5), 0,1 М СаС1з и 1%-й раствор растворимого крахмала (навеску крахмала растворяют в небольшом объеме холодной воды, после чего вливают при постоянном помешивании в доведенную до кипения воду). Реакцию гидролиза крахмала начинают добавлением 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубируют в течение 10 мин при 25 С, затем реакцию останавливают добавлением 1 мл 1 М НС1, прибавляют 0,2 ьи 0,5%-го раствора йода в 5%-м водном растворе К1 и измеряют оптическую плотность на спекгрофотометре при б20 нм или па ФЭК (фильтр М 7) против воды. Контрольную пробу ставят с прокипяченным раствором фермента.
Действие фермента учитывают по разнице в окраске между контрольной и опытной пробами. За единицу амилолитической активности условно принимают такое количество фермента, которое вызывает снижение оптической плотности при 620 нм на 0,01 ед. в 1 мин при рН 5,5 и температуре 25'С. Другой метод измерения и-амилазной активности основан на количественном определении образованной в результате гидролиза крахмала глюкозы. Реакционны смесь содержит 1%-й растворимый картофельный крахмал в 50 мМ Ха-апетатном буфере (рН 5,5) и раствор фермента.
Реакцию останавливают после 10 мин инкубации при 55'С добавлением равного объема ДНСК-реагента (см. 13.2.2). Контрольную пробу ставят с прокипяченным раствором фермента. Количество редуцируюшях сахаров определяют колорнметрическим методом с ДНСК-реагентом. Для этого пробирки инкубируют в те ~ение 5 мин в кипящей водяной бане для развития характерной красно-коричневой окраски, охлаждают реакционную смесь и измеряют поглощение при 540 нм. Количество гидролизованного крахмала определяют по калибровочной кривой, построенной на основании поглошения раствора глюкозы. За единицу активности фермента принимают количество амилазы, которое образует ! мкмоль редуцирующих сахаров (глюкозы) в минуту при указанных условиях реакции. 13.2.4. Мал ьтаза Мальтаза (а-глюкозидаза, НФ 3.2.1.20) гидролизует 1,4-связи концевого нередуцнующего остатка а-.О-глюкозы с освобождением а-глюкозы.
Фермент содержится в плесневых грибах, дрожжах и бактериях. Плесневые грибы содержат истинную мальтазу, а дрожжи — менее специфичную а-глюкозидазу, действующую и на другие а-глюкозиды. Получение. Мальтазу получают из дрожжей одним из следующих способов. 1. Густую суспензию свежих дрожжей в 0,1 М цитратном буфере (рН 6,5), содержащем ингибиторы протеаз (0,1 М ЭДТА; 1 мМ ДТТ; 0,17 мг/мл фснилметилсульфонилфторида; 0,7 мкМ пепстатина), растирают с кварцевым песком или со стеклянным порошком в фарфоровой ступке в течение 5 мин.
2. Прессованные дрожжи растирахп с сухим (1'(Н4)зНР04 и экстрагнруют фермент 10-кратным количеством воды. 3. Прессованные дрожжи измельчают, расстилают тонким слоем на листы фильтровальной бумаги и медленно высушивают в токе воздуха при 40 С.
Из сухих дрожжей мальтазу извлекают настаиванием с водой. Полученные гомогенизаты центрифу~ируют (1! тыс. 8, 10 мин, 4 'С), суцернатанты используют для определения и-глюкозидазной активности. Определение. Мальтазную активность измеряют спекгрофотометрически с в-нитрофенил-и-11-глюкопиранозидоы в качестве субстрата но увеличению поглощения при 405 нм в результате освобожденна в-ннтрофенола (коэффициент молярной экстинкции 18,3 мМ ' .
см '). В спектрофотометрическую кювету вносят 1 мл раствора в-нитрофенил-глюкопиранозида в 50 мМ К-фосфвтном буфере с рН 6,8 (1 мг/мл) и измеряют оптическую плотность прн 405 нм. Затем добавляют 50 — 100 мкл бесклеточного экстракта и продолжают измерение. Контрольную пробу ставят с прокипяченным раствором фермента. Удельную активность выражают в наномолях в-нитрофенола, образующегося в минуту на 1 мг белка. За единицу мальтазной активности принимают такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль л-нитрофенола в 1 мин при рН 6,8 и 25 'С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
