А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 56
Текст из файла (страница 56)
В бесклеточных экстрактах а-глюкозидазу можно определять спектрофотометрически в системе, сопряженной с глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и гексокиназой. В присутствии АТФ и гексокиназы происходит фосфорилирование образовавшейся в результате мальтазной активности глюкозы в глюкозо-б-фосфат.
Далее п|юкозо-6-фосфат окисляется глюкозо-6-фосфатдегндрогеназой с образованием эквивалентных количеств НАДФН, который определяют спектрофотометрнчески. В спектрофотометрическую кювету вносят реакционную смесь, содержащую 50 мМ имндазольный буфер (рН 7,0), 1 мМ М8С1„3 мМ АТФ, 0,4 мМ НАДФ', по 0,5 единиц глюкозо-6-фосфатдегндрогеназы и гексокиназы на ! мл и необходимое количество экстракта. Пробу перемешивают н измеряют оптическую плотность при 340 нм до ее стабилизшши. После этого добавляют сахарозу до конечной концентрации 50 мМ. Содержимое кюветы быстро перемешивают и продолжают измерение оптической плотности при 340 нм до прекращения ее изменения.
Количество глюкозы в пробе рассчитывают по количеству образовавшегося НАДФН, используя коэффициент молярной экстинкции 6220 мМ '.см '. Растворы ферментов, НАДФ и АТФ должны находиться в ледяной бане. За единицу мальтазной активности принимают такое количество фермента, которое образует 1 мкмоль глюкозы в 1 мин при рН 7,0 и температуре 25 'С. 13.2.5. Протеазы Протеазы — Ферменты, гидролизующие белки и полипептиды по месту пептидной связи.
В зависимости от степени сложности гидролизуемого суб- 190 с!рата различают протеиназы, полипептидазы и дипептидазы. Протеиназы действуют на нативные белки с образованием пептидов. Полипептидазы и дипептидазы действуют соответственно на полипептиды и дипептицы с образованием аминокислот. Протеолитические ферменты широко распространены у микроорганизмов.
Микробные протеазы делят на три класса: сериновые, металлопротеазы и кислые, имеющие оптимум рН при щелочной, нейтральной и кислой реакции среды соответственно. В силу отсутствия белков и полипептидов строго определенного состава раздельное определение протеаз затруднено, поэтому проводят суммарное определение протеаз. Определение.
Для определения суммарной активности протеаз используют колориметрический метод, основанный на измерении поглощения пигмента, высвободившегося в раствор в результате гидролиза окрашенного нерастворимого аналога белка ферментами. В качестве пигментированных аналогов белков используют азоказеин или азоколлаген, имеющие сульфаниламидные группы, ковалептно присоединенные к пептидным связям. Для приготовления раствора субстрата 500 мг окрашенного белка растирают в фарфоровой ступке, постепенно добавляя 100 мл 20 мМ глрис-НС! буфера (рН 7,8) до получения равномерной взвеси. Реакционная смесь солержит 1 мл раствора субстрата; 0,5 мл 0,2 М юрис-НС! буфера (рН 7,8); 0,5 мл препарата фермента. Пробы инкубируют при 37 С в течение 10 — 15 мин, после чего реакцию останавливают добавлением 2 мл 10%-й трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В контрольную пробу 0,5 мл препарата фермента вносят после добавления ТХУ.
Нс подвергнутый протеолизу субстрат отфильтровывают через бумажные фильтры (1Уйа!шап )Ча ! ). В фильтратах спектрофотометрически определяют при 366 нм количество высвободившегося под действием протеаз красно-оранжевого пигмента (е = 900 М. ' см '). За единицу протволитической активности принимают количество фермента, необходимое для освобождения 1 мкмоля пигменга в минуту при указанных условиях реакции. Суммарную активность протеаз можно определить, используя более лоступный субстрат — 1%-й раствор казеина в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5).
В целях нахождения линейного участка зависимости протеолитической активности от времени ставят серию проб: пять опытных и одну ко1ггрольную. В кажлую пробу вносят по 1„0 мл раствора казвина и 0,5 мл культуральной жидкости, затем реакционные смеси инкубируют при 37'С. В пробах последовательно, с интервалами в 2 мин останавливают реакцию добавлением 1,5 мл холодной 10%-й ТХУ для преципитации не подвергнутого ферментативному гидролизу белка. В контрольную пробу вносят 0,5 мл культуральной жидкости после добавления ТХУ.
Пробы выдерживают при комнатной температуре в течение 20 — 30 мин для формирования преципитатов, после чего суспензии фильтруют через бумажные фильтры (%Ьагшап )а 1). В фильтратах определяют белок методом Лоури. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое гидролизует казеин с образованием окраски (с реактивом Фолина— Чокальтеу), эквивалентной освобождению 1 мкмоль (181 мкг) тирозина в 1 мин при рН 7,5 и температуре 37'С.
13.2.б. Уреаза Уреаза (НФ 3.5.1.5) катализирует гицролиз мочевины до аммиака и углекислоты: ()ЧНд)!СО + ЗНтО -+ 2)ЧЖОН + СОт Фермент специфичен к мочевине. Уреаза обнаружена у многих бактерий, плесневых грибов и некоторых дрожжей. Оптимум рН уреазы близок к 7,0. 191 Определение. Уреазную активность измеряют по скорости образования клетками или грубыми экстрактами аммиака из мочевины. Для этого отмытые клетки или грубый экстракт помешают в доведенный до нужной температуры 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,0). Реакцию инициируют добавлением мочевнны до конечной концентрации 10 мМ, отбирают нулевую пробу, затем инкубируют реакционную смесь при желаемой температуре, отбирая пробы через определенные промежутки времени.
Клетки в пробах осаждают центрифугированием (10 тыс. 8, 5 — 10 мин). Контрольную пробу ставят с прокипяченной аликвотой клеточной суспензии или раствора фермента. Аммоний-ион в пробах определяют по методу гРосетта и Скотта. Определение основано на реакции между аммиаком, фенолом и гипохлоритом, протекающей в щелочном растворе с образованием интенсивной синей окраски индофенола.
К 0,2 мл анализируемого материала добавляют последовательно 0,8 мл раствора А и 0,8 мл раствора Б. Реакционную смесь тшательно перемешивают и инкубируют при 37 'С в течение 30 мин. Образование окрашенного комплекса регистрируют при 578 нм в термостатированной спектрофотометрической кювете при 37 С против конзроля на реактивы. Количешво образовавшегося аммония определяют по калибровочной кривой, которую строят па стандартному раствору сернокислого аммония, содержащему 1 — 15 мкг аммоний-иона в 1 мл. За единицу уреазной активности принимают такое количество фермента, которое образует 2 мкмоля )ЧН 4 в 1 мин при рН 7„0 и температуре реакции.
Раалвор А для хромогенной реакции содержит (г/л): фенол — 10; нитропруссид Иа— 0,05. Раствор Б содержит 37 г/л ХазНР04,' 10 г/л )чаОН и 10 мл/л 1%-го ИаОС!. Растворы А и Ь хранят в сосудах из темного стекла не более двух месяцев. 13.2.7. Целлюпаза Целлюлаза — сложный ферментный комплекс, участвующий в разложении целлюлозы у микроорганизмов. Целлюлоза является основным структурным компонентом растительных клеток и одним из наиболее распространенных органических соединений. Целлкшоза — линейный полимер из глюкозных остатков, соединенных 1,4-!)-связями, число которых достигает нескольких тысяч.
Индивидуальныс цепочки полимера могут соединяться друг с другом водородными связями, образуя кристаллическую структуру, при этом участки„имеющие кристаллическое строение, чередуются с аморфной целлюлозой. Целлюлозолитической активностью обладают многие аэробные микроорганизмы: миксобактерии (Ро1уал81тыл, Юрогалд!ит), представители группы Сугорйаяа, а также грибы (Риъапцт, Тпслог)егта, РетссП!ит). В анаэробных условиях целлюлозу разлагают в основном клостридии. На грибах было показано. что фермснтная система для разложения целлюлозы включает 1,4-1)-эндоглюконазы, неупорялоченно разрывающие 1,4-1)-связи внутри макромолекулы, 1,4-р-экзоглюконазы, отщепляющие с нередуцирующих концов дисахарид целлобиозу, и 1,4-))-глтокозидазы, гидролизующие целлобиозу с образованием глюкозы.
Грибные целлюлазы имеют оптимум рН в кислой области (4,5 — 5,5), а оптимум температуры около 40 С. Определение. О целлюлазной активности судят по скорости образования редуцируюших сахаров пол действием фермента. В качестве субстрата для целлюлазы можно использовать фильтроватьную бумагу (%пандан )чз 1), карбоксиметилцеллюлозу (аморфная целлюлоза), хлопок (кристаллическая структура). К смеси из 1 мл О, ! М Иа-ацетатного буфера (рН 5,2) и 1 мл раствора фермента (кульгуральная жидкость) добавляют 20 мг измельченного субстрата.
Реакцию проводят при 37 — 40'С в течение 1 ч. затем пробы помещают в кипящую водяную баню на 5 мин для прекращения гидролиза. Пробы доводят до комнатной температуры и опрелеляют в них количество образовавшейся глюкозы колориметрическим методом с ДНСК-реагентом (см. ! 3.2.2). Контроль ставят с прокипяченным раствором фермента. 13.2.8.
Алкогольоксидаза Алкогольоксидаза (АО, НФ 1.!.3.13) — растворимый фермент, отвечающий за первую реакцию окисления метанола у метилотрофных дрожжей. Он локализован в пероксисомах, выросших на среде с метанолом клеток, и его содержание в клетке люжет достигать 20 % от всех растворимых белков. Активность фермента изучают в гомогенатах, полученных после растирания клеток, замороженных в жидком азоте, или после обработки их на прессе.
Определение основано на количественном измерении изменения концентрации перекиси водорода, образующейся в реакции окисления метанола АО: СНЗОН + Оз + НСОН г НтОз Реакционная смесь содержит в 1 мл: КРО,-буфер с о-дианизидином (рН 7,0, 50 мМ) — 970 мкл; раствор пероксидазы хрена (10 МЕ) — 10 мкл; метанол (10 мкмоль)— Гб мкл, раствор фермента (0,5 — 1 мг белка) — 10 мкл. Буферный раствор с о-дианизидином готовят следующим образом. К 9 мг о-дианизидина приливают 10 мл ацетона, растворяют реактив и приливают 90 мл КРО,-буфера (рН 7,0. 50 мМ).
Раствор стабилен при 4'С в течение недели. Реакцию начинают добавлением фермента (АО) и изменение поглощения раствора регистрируюг' при 436 нм в течение 1 — 2 мин. За единицу активности АО принимают количество фермента, которое окнсляет 1 мкмоль метанола в минуту при рН 7,0 и 20 С. Расчет активности Фермента проводят с учетом коэффициента молярной экстннкций о-дианизидица — 8,3 мМ '.см '. 13.2.9. Глюкозооксидаза Глюкозооксидаза (ГО, НФ 1.!.3.4) — растворимый внеклеточный фермент, образуемый многими микромицетами. Определение основано на количественной оценке изменения концентрации перекиси водорода, образующейся в реакции окисления глюкозы ГО: глюкоза + Оз -ь глюконолактон м Нз07 Реакционная смесь содержит в 1 нш (мюг): КРО4-буфер с о-дианизилином (рН 7,0, 50 мМ) — 970 (приготовление см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
