А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 60
Текст из файла (страница 60)
В стационарных жидких культурах большинство метилобактерий образуют розовое кольцо на поверхности среды. Все штаммы — аэробы, каталазо- и оксидазоположительны. Они являются хсмоорганотрофами и факультативными метилотрофами, способными окислять целый ряд С,-соединений. Метилобактерии растут на средах с формальдегидом (в микромолярных концентраци- 202 ях), формиате и метаноле, некоторые используют метилированные амины. Субстраты С, ассимилируют через ицл-сериновый цикл и проявляют активность всех ферментов цикла лимонной кислоты при росте на сложных органических субстратах. Рост оптимален при нейтратьных значениях рН среды, однако некоторые штаммы способны расти при рН 4 и до рН 10. Все штаммы образуют урсазу (см.
13.3), некоторые способны к нитратредукции, а тест Фогеса — Проскауэра для всех метилобактерий отрицателен. Большинство штаммов чувствительны к антибиотикам: канамицину, альоамицину Т, стрептомицину, фрамицетину и особенно к теграциклину. Многие штаммы, однако, устойчивы к цефалоспорину, налидиксовой кислоте, пенициллину, бацитрацину, карбенциллину, колистинсульфату, полимиксину В и нитрофурантоину. Наряду с С,-субстратами больцшнство метилобактерий используют для эоста глицерол, малонат, сукцинат, фумарат, 2-оксоглутарат, Ш-лактат, Ш.-малат, ацетат, пируват, цропиленгликоль, этанол.
Некоторые штаммы могут засти, кроме названных, на средах с арабинозой, глюкозой, ксилозой, фукозой, галактозой, фруктозой, аспартатом, глутаматом, цитратом, цитраконагом, моно-, ди- и триметиламинами, этаноламином, бугиламином, диметил—.лицином и бетаином. Ни один из изученных штаммов не использует дисахарцды или сахароспирты. Лммоний, нитрат и мочевина могут служить источниками азота. Состав жирных кислот обычно представлен Спи-мононенасыщенными кислотами с прямой цепью, а мол.
% ГЦ в ДНК варьирует от 68 до 72. В некоторых штаммах метилобактерий обнаружен бактериохлорофилл, гго говорит о их возможной связи с предшественниками современных фототрофных бактерий. По современной филогенетической классификации метилобактерии размещены в ветке филогенетичсского древа, образуемой комплексом ЛроЬасгепит — КЬцо)див. Хотя метилобактерии рассматривались в качестве кандидатов на продуценты белка, их степень конверсии (преобразование углерода субстрата в углерод оиомассы) не вылержала конкуренции с другими метилотрофами. Поэтому метилобактерии в настоягцее время рассматривают в качестве потенциальных продуцентов кофермента (),„, аминокислот (г'.-лизина, 7;тирозина, 7.-фенилаланина, 2,-глутамата), витаминов (В„) и как источник поли-1)-оксибугирага.
Их каротиноидные пигменты применяют в качестве природного красителя зля пищевой индустрии (производство маргарина). Высокая устойчивость метилобактерий к облучению гамма-лучами делает эти организмы возможными кандидатами для тест-культур при контроле качества производства пищевых продуктов и упаковочной продукции. Глава 15 АЭРОБНЫЕ ЛИТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ Целый рад микроорганизмов способен окислять различные неорганические соединения с получением метаболической энергии для роста клеток. Прежде всего это две группы нитрификаторов, железоокисляющис бактерии, водород- 203 ные бактерии, метаногены, сульфидогены, денитрификаторы и ацетогены, использующие водород в качестве источника энергии, карбоксидобактерии и некоторые другие микроорганизмы, окисляющие ионы некоторых металлов (сурьмы, марганца). В данной главе будут расслютрены метоцологичсские приемы, позволяющие выделять интересующие хемолитотрофы из природных образцов и изучать их.
Кроме того, в настоящем практикуме имеются задачи по изучению метаболизма чистых культур некоторых литотрофов (см. гл. 24). 15.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ Аэробныс хемолитоавтотрофные водородокисляющис бактерии — физиологически схоцная, но филогснетически разнородная группа организмов, вклкьчающая таксономически различных представителей. Общим свойством членов этой группы является способность использовать газообразный водород как донор электронов и кислород как акцептор, фиксируя СОь т.е.
расти хемолито-. автотрофно. Такие водородные бактерии в строгом смысле отличаются от других микроорганизмов, способных метаболизировать Нз (некоторыс циазотрофы, энтеробактерии и др.), однако не фиксирующих при этом СОь К тому же они отличаются от микроорганизмов, использующих водород в анаэробных условиях при сульфатном, серном или карбонатном дыхании (например, РелиеотЬпо, 2Ьеппоргогеия, гугойсг)игп, С!оьчпд1шп асейсипй АсегоЬасьег1шп 1чоодй и Мегйапояатпа Ьагкеп).
Водородные бактерии, в строгом смысле, являются в основном факультативныльи автотрофами, способными расти гетеротрофио на средах с различными органическими субстратами в качестве доноров энергии и углерода. Возможен также миксотрофный рост. Большинство водородных бактерий растут на средах с органическими веществами быстрее, чем на средах с водородом. Наряду с этим выделены и описаны три вида облигатных хемолитотрофных водородных бактерий: два термофила (НуФодепоЬас~ег Яегторй~!ил и СаЫегоЬасгепигп ЬудгояепорЫ!ит) и один галофил (штамм МН 11()). В окисление водорода вовлечены цве различные гилрогеназы. Одна из пих растворимая цитоплазматическая, НАД'-зависимая (водород: НАД'-оксидоредуктаза), другая — мембраносвязанная, не- НАД'-зависимая.
Некоторые водородные бактерии содержат одну из этих гидрогеназ, другие — обе. Метаболизм углерода у воцородных бактерий протекает с участием восстановительного рибулозобисфосфатного цикла (цикла Кальвина), и комбинация этих двух активностей (использование водорода и фиксация СО,) уникальна в биологическом мире. 15.1.1. Методы выделения водородных бактерий Принципы, лежащие в основе выделения водородных бактерий, просты по определению: только они могут расти аэробно и автотрофно, используя водород в качестве единственного источника энергии.
Преимущественно применяют два способа выделения воцородных бактерий — прялюй чашечный метод и метод получения жидких накопительных кульп1ур. 204 Прямое выделение водородных бактерий иа чашках с селективной твердой средой приводит к появлению колоний различных микроорганизмов как быстрорастущих, так и медленнорастущих культур. Около 1 г почвы или ила суспендируют в 10 мл стерильного раствора !4аС1 (0,9%- го).
Смешивают 1 мл этой суспензии (или се серийные разведения в том же растворе) в чашке Петри с 20 мл минеральной среды с агаром высокой степени чистоты, расплавленной и остуженной до 45 С (состав см. в приложении 4). После застывания агара чашки помещают в экснкатор, в котором воздух заменяют на газовую смесь, содержащую 5% О,, е5 % Н, и 10% СОь Альтернативно этому небольшие аликвоты суспензий могут быть распределены шпателем по поверхности плотной среды. Для посева из жидких проб, где концентрация водородных бактерий невелика (пруды, озера), можно применять предварительную концентрацию образцов (2 — 500 мл в зависимости от концентрации клеток) на мембранных фильтрах (0,22 — 0,45 мкм). Мембраны затем раскладывают на поверхности чашек со средой, причем чашки должны быть предварительно подсушены в ламинаре. В ~аких условиях выращивания многие олигокарбофильные бактерии будут также развиваться на сашках.
Для выявления колоний водородных бактерий можно применить технику обнаружения их на фильтрах с подращешгыми колониями с использованием трифепилтетразолия хлористого (ТТХ). Фильтры переносят на несколько слоев фильтровальной бумаги в чашке Петри, смоченных свежеприготовленным раствором 0,1%-го ТТХ и иихубируют в течение !0 мин на воздухе в темноте. Некоторые колонии приобретают при этом красный цвет вследствие осаждения формазана. Такие колонии должны быть отброшены.
11оследующая инкубация мембран в атмосфере 90% Н, и 10% О, приводит к окрашиванию гидрогеназположительных колоний. Такая обработка не вызывает гибель клеток, и колонии водородных бактерий могут быть пересеяны на свежую среду для выделения чистой культуры. Выделение водородных бактерий с яспользованиелг жидких накопительных культур. В противоположность прямому чашечному методу выделения, постановка жилких накопительных культур приводит к возникновению конкуренции среди водородных бактерий и селекции наиболее быстрорастущих форм. Эта техника удобна для выделения быстрорастугцих и образующих большую биомассу водородных бактерий, что важно зля применения в биотехнологии.
Накопительные культуры следует пересевать каждые 1 — 5 дней. Для одновременного вылеления быстро- и медленпорасгущпх клеток из природных образцов делают серию 10-кратных разведений и засевают из них среды с 9 мл жидкости в пробирке (ь! мл посевного материала из соответствующего разведения). Из каждого разведения необходимо засевать не менее 5 пробирок. Пробирки помешают в эксикатор, в котором создают соответствующую газовую среду и инкубируют в термостате стационарно или с покачиванием. Через 1 — 2 нед отмечают рост в пробирках и пересевают их для вьщеления чистых культур.
Одновременно этим же способом можно определить наиболее вероятное число водородных бактерий в пробе (по таблицам МакКреди: см. гл.!3). 15.1.2. Выделение чистых культур Выделения чистых культур добиваются многократным пересевом из отдельной колонии как на минеральную„так и на органическу|о среду. Поскольку большинство водородных бактерий являются факультативными автотрофами, они должны формировать идентичные колонии на чашках с гетеротрофными и автотрофными средами. 205 Выделение различных физиологических подгрупп водородных бактерий. Используя различные среды для накопления, можно преимущественно выделять водородные бактерии, различающиеся по физиологическим свойствам, таким, как способность к фиксации атмосферного азота, использование нитрата как альтернативного кислороду акцептора электронов, рост на СО, пропане и других углеводородах, образование спор, рост при высокой температуре. Другие возможности водородных бактерий включают устойчивость к высоким концентрациям фюсфата, магния или 1чаС!, способность расти при пониженной или новышенной (до 40%) концентрации кислорода, устойчивость к антибиотикам и токсичным субстратам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
