А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 64
Текст из файла (страница 64)
215 Возбудителями масляюкислого и его разновидности аяетояобутиловг»го брожения являются предсчавители рода С1озя Ы1ию. Они широко распространены в природе. Их можно выделить из почвы, навоза, силоса, с поверхности зерен злаков и даже из молока и сыра. Зля получения накопительных культур видов этого рода можно воспользоваться некоторыми их особенностями. Поскольку споры клостридий терморезистентны, инокулят предварительно пастеризуют.
Создавая анаэробные условия, исключают рост всех аэробных бактерий. Клостридиям доступны многие природные субстраты. Они способны гидролизовать полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и сбраживать мономеры, образующиеся в результате гидролиза. На этом основании в качестве источника углерода и энергии для сахаролитических клостридий используют углеводы или полисахариды (чаше всего крахмал), а для пептолитических — аминокислоты или белки.
Некоторые клостридии используют молекулярный азот как единственный источник этого элемента, что может стать дополнительным фактором элективности при постановке накопительных культур. В приложении 4 приводится ряд сред для получения накопительных культур клостридий: картофельная среда с мелом для сахаролитических клостридий, среда Виноградского для клостридий, фиксирующих молекулярный азот и т.д. Накопительную культуру возбудгггеля ацетонобутилового брожения С1ох1г1Жигл асего1»игу11сигл можно получить на средах с кукурузным (ржаным, картофельным) затором.
Пробирки со стерильным 7 — 8%-м кукурузным затором заражают зернами хлебных злаков или комочками почвы и пастеризуют на кипящей водяной бане в течение 45 с. Выращивают при 35 — 37 'С в запаянных ампулах или пробирках под слоем вазслинового масла. Для обогащения среды клостридиями делают несколько последовательных пересевов культуры на кукурузный затор, а затем высевают ее на чашки с картофельным агаром и выращивают в анаэробных условиях — в анаэростатах. М~равьянокислое брожение или, как его еще называют, брожение смешанных кислот, осуществляют энтеробактерии.
Эпидемиологи веское значение этих бактерий известно, а их представитель ЕзсЛепс1яа со11 является общепризнанным в санитарной микробиологии тест-организмом, поэтому выделение этой группы бактерий описано в соответствующем разделе практикума (см. гл. 46). 16.2. яяЕТАНОГЕИЫ Метаногены — строгие анаэробы, обгпающие в донных осадках пресноводных и морских зон, богатых органикой, или в рубце жвачных. Это самая большая группа архей из филума Гцгуагспаео1а. Обычно они являются конечным звеном анаэробной пищевой цепи разложения биологических полимеров и выделяют биогаз в качестве конечного продукта (60 % СН~ + 40 % СО,).
Биогаз образуется на дне озер и болот, поднимаясь вверх, попадает в аэробную зону и используется метанокисляющими микроорганизмами. Метан образуется также в рубце жвачных (корова выделяет до 200 л метана в день) и в кишечнике термитов. По морфологии метаногены варьируют от простых палочек, кокков и сарцин до спиральных форм и неправильных кокков. Рост — от автотрофного и гетеротрофного до метилотрофного, температурные интервалы роста — от 216 цезофильных до экстремально термофильных.
Метаномены используют довольно узкий набор субстратов. К первой группе субстратов относят Нз/СОь СО. При этом 95% фиксированного СО, используется для получения энергии и выделяется в виде СН4 и только 5 % идет на биосинтез. Ко второй группе относят ацетат и некоторые спирты (ацетпкластический метпнпгенез). Третью группу составляют одноуглеродные субстраты (формиат, метанол, метиламин, 2- и 3-метиламины). В морских водоемах сульфатредукторы опережают метаногенов в борьбе за общие субстраты (ацетат и молекулярный водород), однако многие морские метаногены способны использовать метиламины, которые не являются субстратвми для сульфатрсдукторов. Классы Ме1!тапоЬас1ег(а, Ме11запососс!, Мегйапоруп' включают метаногснные археи, образующие метан на Нз/СОп формиате, ацетате, метаноле, метиламинах и Н,/метаноле.
Клетки содержат коферменты М„Еыщ Г,зв, метаноптерин. При освещении светом с длиной волны 420 нм они флуоресцируют сине-зеленым светом (свойство кофакторов Бали Е43в). Для получе~ шя накопительных культур меганогенов следует использовать минеральные среды, содержащие азот в форме )чН4 и серу в Форме 8г . Необходимые микроэлеченты добавляют в виде стерильного концентрированного раствора, а потребность в Факторах роста удовлетворяется добавлением дрожжевого экстракта. При приготовлении сред и растворов добиваются условий строгого анаэробиоза путем кипячения срезы, замены газовой фазы на азот или аргон, добавления редуцируюших агентов и герметизации сосудов для культивирования.
Подлержанию низкого окислительно-восстановительного потенциала способствуют дрожжевой экстракт, добавляемый в среду в качестве источника витаминов и других факторов роста, а также сульфид натрия и цистеин — источники серы. В концентрациях до 100 мг 8Я/л сульфид не оказывает отрицательного влияния на рост метаногенных архей. Для избавления от бактерий в среду добавляют антибиотики широкого спектра действия (циклосерин, пенициллин, зритромицин, стрептомипин и др.) в количестве -0,2 мг/мл. В качестве субстрата в зависимости от потребностей выделяемой группы метаногенных архей вносят ацетат, Формиат, метанол и метиламин в концентрации -10 мМ. Для накощ|ения и выделении водородиспользующих метаногенов газовую Фазу в сосудах для культивирования заменяют на смесь Н, -+ СОг (80 % + 20 %).
Источником биологического материала может служить образец любого анаэрабнага даинпга осадка или рубцовой гкидкасти, отобранный без нарушения анаэробных условий, но предпочтительнее использовать анаэробные осадки, активно образующие биагаз (например„из метантенков). Среды и растворы. Для преимущественного развития„вылеления, очистки и роста культур метаногенов используют среду следующего состава (г/л): КН,Р΄— 0,38; '4агНРО~ — 0,53; !ЧНвС! — 0,30; !ЧаС! — 0,30; СаС1, 2Н,Π— 0,11; М8С1, 6НгΠ— 0,10; зезазурин — 0,00! (ицликатор восстановительных условий); раствор микроэлементов— 1,0 мл/л; раствор витаминов — 0,5 мл/л.
Конечная концентрация микроэлементов в среде должна составить (мг/л): ГеС1,. 4НгО— '3,944; НзВОз — 0,062; ХпС!, — 0,068; СвС1, — 0,013; МпС1, 4Н,Π— 0,061; СоС1, 6Н,О— '),066; 14!С1, — 0,0!3; НС! — 0,002; ХаОН вЂ” 0,400; !чафеОз — 0,017; Ха,ЪЧО, — 0,029; чагМоО4 — 0,021. Конечная концентрация вита яинав в среде составляет (мг/л): биотин — 0,01; Фолиезая кислота — 0,01; никотинамид — 0,10; п-аметобепзойная кислота — 0,05; тиамин В 1) — О,! 0; панготен свая кислота — 0,05; пиридокса мин — 0,25; цианкобаламин (В и)— 9,05; рибофлавин (В,) — 0,05. Минеральную среду кипятят для избавления от кислорода, затем охлаждают до комнатной температуры и разливают под током азота (свободного от кислорода) для 217 предотвращения диффузии кислорода в среду. Среды разливают во флаконы, закрывают резиновыми пробками и зажимают алюминиевыми колпачками.
Затеи газовую фазу во флаконах дополнительно заменяют на требуемую: Аг, )Чь Нь Х,/СО, (80/20) или Н2/СО, (80/20). Конечное давление во флаконах составляет -1,6 ат. Среды стерилизуют автоклавированием (1 ати), а раствор витаминов — фильтрованием (бактериальный фильтр диаметром 0,2 мкм). После стерилизации в среды добавляют раствор Хазб 9НзО до конечной концентрации 278 мг/л, витамины, а клюке требуемое кш|ичество стерильного субстрата (см.
выше). Все пересевы микроорганизмов осуществляют с помо|цью стерильных шприцев, не нарушая условий анаэробиоза. Накопительные культуры метаиогенов. Для полученил накопительных культур в анаэробную стерильную среду вносят до 20% (объем/объем) гомогенизированной пробы анаэробного осадка. После стерилизации среды устанавливают рН б,8 — 7.0. Культивирование накопительных культур проводят при 30 или 37 'С. Для накопления метаногепов в среду вносят 0,04% дрожжевого экстракта.
Для накопления Меглалогаецмподобных архей дрожжевой экстракт в среду не вносят. Культивирование водородиспользующих метаногенов проводят на орбитальной качалке или шейкере для лучшего газообмена. Развитие накопительной культуры контролируют люминесцентпой (отмечают флуоресценцию при 420 нм) и световой микроскопией (отмечают наличие клеток разной морфологии, преимущественно метанококков, обладающих наиболее быстрым ростом). С помощью газожидкостной хроматографии определяют убыль субстрата и появление метана. Описывают изменения культуральных признаков (авспуханиеь анаэробного осадка, появление пузырьков газа и др.).
Для получения чистых культур метаногенов используют рассев накопительной культуры на поверхность или в толщу агаризованной минеральной среды того же состава (с 1,5 — 2% агара). Стерильную анаэробную агаризованную среду в плотно закупоренных сосудах расплавляют, остужают до 45 С и стерильным шприцем вносят аликвоту кульгу(зальной жидкости из накопительной культуры с соблюдением условий анаэробиоза.
После тщательного перемешивания содержимого сосуда его либо оставляют в горизонтальном положении для застывания, либо раскатывают рукой по ровной поверхности до затвердевания агара по стенкам сосуда в виде тонкого слоя. В обоих случаях лобиваются получения максимальной поверхности агаризованной среды. Допустим рассев накопительной культуры на поверхность твердой среды в чашках Петри петлей или шпателем при работе в алаэроблом боксе и последующей инкубации посевов в алаэростагле.
Культивирование ведут при 30 или 37 С до появления отдельных колоний. Для выделения Меглилозаега-подобных мстаногенов, которые практически не растут на твердых средах, применяют метод предельных разведений в жидкой среде с ацетатом в качестве субстрата. Чистоту вьщеленных культур оценивают по однородности полученных колоний и микроскопической картине, а также путем рассева на твердые среды в анаэробных условиях (в анаэробном боксе). Материал берут из отдельной колонии с помощью микробиологической иглы или петли и осуществляют поверхностный посев на среду в чашках Петри. При глубинном посеве в толщу расплавленной агаризованной среды стерильным шприцем вносят суспензию клеток из отдельной колонии, приготовленную в стерильном анаэробном физрастворе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
