А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 67
Текст из файла (страница 67)
Еше в начале ХХ в. Е.Е. Успенский обнаружил, что в природных водоемах в зависимости от концентрации ряда элементов внешний вид (габитус) водорослей (например, представителей родов Ргггра!пи!г)!и, ЫЛеос!отипг, 5)7!гоВуга) может сильно меняться. Поэтому некоторые из них он даже предлагал использовать как индикаторные виды на содержание в водоемах железа, азота и фосфора'*. Избыток фосфора в среде иногда может вызывать у цианобактерий потерю чехлов, появление инволюциогпгых форм. Рост ряда цианобактерий подавляют ничтожные концентрации ионов меди, что приходится учитывать при использовании металлических дистилляторов. Как правило, среды для цианобактерий и водорослей готовят на дистиллировагпгой (или бидистиллированной) воде, однако при первых посевах часто рекомендуют разводить среду простерилизованной природной водой (взятой из того водоема, откуда отобрана проба), постепенно уменьшая ее долю в среде.
Для приготовления тверлых сред для цианобактерий и водорослей чаше всего используют хорошо очищенный 2%-й агар-агар (или 1,5%-й агар марок Васго„П(йсо), иногда силикагель. Культивирование на твердых средах проводят в чашках Петри или пробирках со скошенным агаром. Кроме того, циано- * Репегпы этих и друпгх упоминаемых в главе срел лля пианобакгерий и водорослей можно нанти в руковолствах: Культивирование коллекпионных гдтаммов водорослей / Под ред проф. ГьВ.Громова.
— Ле Изд-во ЛГУ, 1983! Усненския В.И. Экология и физиология питания пресноводных водорослей. — Мл Изд-во МГУ, 1966; !аллврбах г!6М., Штина З.А. Почвенные волорослп. — Ле Изд-во АН СССР, 1968; Методы физиолого-биохимического исследованил водорослей в гидробиологической практике. — Киев: Наукова думка, 1975. Зенава Г.М., Штина З.А. Почвенные волоросли. — Ме Изл-во М1 У, 1990; Андреева М. В.
Почвенные и аэрофпльныс зеленые водоросли. — СПбл Наука, 1998; Вегаеу'з Магида! оу зуз!станс Вас!епо!оау 1.. К Восле, К. Уу Самеп1то1г, ебв. Уо! 1. — 1Чегг Уог1г; Негбе1ьегб; Вег!1п; зрплйсг уег!аа, 2001.— Р. 485 — 487; и др. в* зсненекий К Железо как фактор распределения водорослей. — Ма Изд-во МГУ, !925. Си. также: успенская Взь экология и физнолоп~я питания пресноводных волорослей. — мл изд-вг МГУ, 1966. 224 бактерии рекомендуют выращивать в пробирках с полужидкой агаризованной =редой (0,5 — 0,8% агара), в которой их клетки меньше подвержены высыханию и дольше сохраняются.
Получение накопительной культуры. В наиболее распространенном случае небольшое количество отобранного образца (пробы воды, ила, почвы, зеленого налета с поверхности и т.д.) вносят в колбу, на '/з объема заполненную жидкой средой, и помещают ее на свет, в условия естественного освещения ~ как правило, на северное окно) или в люминостат.
Прямого солнечного света желательно избегать. Засеянные колбы выдерживают при умеренной освещенности и температуре 20 — 25'С от нескольких дней до 2 — 3 мес, отмечая появление визуально заметных признаков роста. Далее в зависимости от целей ис:ледования полученную накопительную культуру описывают, определяют, зассевают на питательные среды для получения чистых культур и т.д. Для определенных групп организмов создают соответствующие элективные условия: например, протококковые водоросли получают преимущество перед другими $ототрофами при высокой интенсивности света; цианобактерии (в ряде случаев) — при повышенной температуре (35 'С); азотфиксируюшие цианобактезии — при отсутствии в среде соединений азота и т.д.
Однако не все пианобактерии и водоросли (особенно почвенные) удается ;разу вырастить и выделить в жидкой среде, поэтому иногда их выделяют на различных твердых субстратах. Некоторые из таких методов разработаны очень завис, но могут оказаться полезными и в настоящее время. Наиболее простой лз них, метод почвенных культур, заключается в том, что образец почвы помещают в чашку Петри, равномерно увлажняют дистиллированной или водопроводной водой и выдерживают на свету при постоянной влажности в течение 2 — 4 мес.
За это время почвенные водоросли и цианобактерии разрастаютя внутри и на поверхности почвы, а также на внутренней поверхности чашки Петри, откуда их можно взять для приготовления препаратов и посева в питательную среду. Удобным вариантом описанного метода является лочвеьнав культура св втеклаив ~браованив. В этом случае исследуемую почву ровным слоем вносят в чашки Петри, ,влажняют, раскладывают на ней несколько стерильных покровных стекол, слегка прижимая их к почве пинцетом или стеклянной палочкой, и гюмещают на свет.
Мелкие свободные пространства под стеклами представляют собой своеобразные влажные : амеры, в которых создаются условия для развития водорослсй. Через разные промежутки времени (от 2 — 3 нел ло 2 — 3 мес) покровные стекла последовательно снимают л готовят препараты для микроскопирования или отсевают выросшие организмы в питательные среды. Последовательный просмотр стекол обрастания дает возможность выявить сукцессию в развитии микроорганизмов (обычно первыми вырастают зеленые водоросли, затем пианобактерии, позднее лиатомовые водоросли) и выбрать подходя:лий момент для посева.
Предложенный М.М.! оллербахом легввд выделеная водорослей в ввввавьи камерах зозволясг изолировать водоросли с разным отношением к влажности. В коническую колбу помещают предварительно стерилизованный кварцевый песок и засевают почвенной =успензией, которую распределяют по всей поверхности песка. После этого колбу на"чоняют, чтобы одна часть песка была лишь влажной, а другая часть находилась пол ьпоем жидкосги. В наклонном положении колбу помещают на свет. После развития водозослей их пересевают в чашки Петри на среду, содержащую почвенную вытяжку с 1% лгар-агара. Развитие водорослей становится заметным по прошествии 2 — 3 нед, 225 нпргсь» Метод гюнвенных кулынур с г!яальтровальнвй бумагой заключается в следующем.
В чашку Петри помешают исследуемую почву споем около 1 см, хорошо увлажняют дистиллированной водой, выравнивают поверхность и покрывают кружком фильтровальной бумаги, Чашку Петри выдерживают ори рассеянном свете и 20 — 25 С, увлажняя фильтровальную бумагу по мере ее высыхания. В пределах от 2 до 60 сут через поры фильтровальной бумаги прорастают различные цианобактерии (хуже проникают более крупные водоросли).
Недостаток метода связан с тем, что на фильтровальной бумаге могут обильно развиваться целлюлозолитические бактерии и грибы, изменяя ее свойства и делая непригодной дп» роска водорослей. Образец исследуемой почвы можно также рассеять непосредственно на поверхность твердой среди (в чашке Петри) е виде почвенного мепкозема. На свету вокруг комочков почвы хорошо разрастаются цианобахтерии, диатомовые и зеленые водоросли, которые затем удается подцепить петлей и выделить в культуру. Аналогичный посев «росеыцью» на твердую среду лает хорошие результаты при выделении цианобактерий и водорослей с поверхности камня и других твердых с> бстратов.
Вьщеление чистой культуры. В опюшении водорослей и цианобактерий используют устоявшиеся, хотя и не совсем точные, понятия альгологически чиста» культура (т.е. культура только одного вида цианобактерий или водорослей) и аксенична», бахтериальпо чиапа» культура (т.е. культура водоросли, не содержащая бактерий, и культура цианобактерии, не содержащая других бактерий).
Для получения альгологически чистой культуры используют обычные микробиологические методы: разведение и пересев накопительной культуры или посев клеток, которые отделяют с помон(ью микроманипулятора. В первом случае небольшое количество накопительной культур!я микроорганизмов переносят в чашку Петри с твердой средой; петлей или шпателем распределяют ее по поверхности среды и далее инкубируют на свету до появления видимых признаков роста.
Из выросших изолированных колоний или скоплений трихомов переносят часть материала на новую среду, многократно (10 — 20 раз) повторяя пересевы. При пересевах используют как твердые, так и жидкие срелы. Кроме того, иногда рекомендуют использовать двуслойную среду (на агаризованную скошенную среду в пробирке наливают 2 — 5 мл жидкой среды и вносят в нее культуру), развитие как бы на поверхности раздела двух фаз интенсифицирует рост водоросли и облегчает выделение ее в культуру.
Для выделения подвижных организмов, например Овс(!!а!ос!а, можно воспользоваться их способностью к фототаксису. Небольшой комочек нитей цианобактерии вносят в чашку Петри с агаризованной средой. Чашку помещают на свет, прикрыв одну ее часть (куда произведен посев) черной бумагой. Нити цианобактерии начинают двигаться по направлению к свету; через несколько часов инкубации их можно подцепить петлей или тонкой иглой на некотором расстоянии от места посева и поместить в свежую среду. Процесс проводят под контролем микроскопа (при малом увеличении). Выделение альгологически чистых культур довольно крупных микроорганизмов, видимых под лупой (10 — 20х), можно осуществить с помощью пипеток или капилляров с последующим высевом в питательную среду.
Для получения культур ряда водорослей (Я(аеас!он(ит, йгара!паЫра, Оес(ояотит, Иойлх) рекомендуют рассевать их зооспоры. Получение бактериально чистых культур цианобактерий и водорослей сопряжено обычно с немалыми трудностями. Это обусловлено их значительно 226 более крупными размерами клеток по сравнению с клетками бактерий-спутников, образованием чехлов и слизи, в которых эти бактерии часто обитают и питаются, а также собственно биологической природой устойчивости альго- и цианобактериальных ассоциаций. Тем не менее в коллекциях микроорганизмов имеется большое количество аксеничных цпаммов цианобактерий и водорослей, а в литературе описан ряд методов их выделения.
Самым распространенным является классический метод выделения чистых культур из изолированной колонии, позволяюи!ий получить в чистой культуре, прежде всего, одноклеточные формы. Для успешного выделения рекомендуется отбирать микроколонии фототрофов, как можно более удаленные от колоний сопутствующих микроорганизмов. Они хорошо различимы при малом увеличении микроскопа. Вначале просматривают (не открывая!) перевернучъте чашки с выросшими микроколониями, отмечая их на донышке чашки, а затем из открытых чашек выбранные микроколонии отсевают в пробирки с 2— 5 мл жидкой питательной среды.
Процесс проводят под контролем микроскопа. Пробирки помещают на свет и по мере роста культур контролируют их чистоту как микроскопически, так и высевом на богатую среду, например МПБ с 0,1 ус глюкозы. Один из способов вьщеления чистой культуры СНогеПи зр. заключается в чередовании пересевов водоросли на минеральную и богатую (например, с глюкозой) твердую среду, обеспечивающую интенсивный рост и быстрое появление колоний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
