А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 69
Текст из файла (страница 69)
При простоге состава многие среды довольно сложны в приготовлении, в частности, поскольку содержащиеся в них восстановленные ве!цества„устойчивые в анаэробных условиях, легко взаимодействуюг и окисляются в присутствии Оь Поэтому среды часто готовят, сливая несколько отдельно простерилизованных растворов непосредственно перел посевом, и затем доводят рН до нужного значения с помощью стерильных растворов кислоты или щелочи (соды). Для получения накопительной культуры фототрофных бактерий обычно используют жидкие среды.
Небольшое количество отобранной пробы ила или воды вносят в пробирку или флакон, доверху заливают питательной средой и герметично закрывают пробкой. После посева пробирки и флаконы помещают в люминостат и выдерживают в течение нескольких суток, пока среда не приобретет характерный лля фототрофных бактерий красноватыи или зелсновазый оттенок. Полученную накопительную культуру используют в качестве инокулята лля дальнейшего культивирования и выделения чистых культур бактерий. Другой способ посева при получении как накопительных, так и чистых культур фототрофных бактерий — это непосредственный посев в пробирки с агаризованной средой для получения изолированных колоний.
Небольшое количество посевного материала вносят в пробирку, заливают расплавленной теплой питательной средой и быстро перемешивают. Для получения отдельных колоний рекомендуется сделать 8— !О серийных разведений посевного материала (с шагом приблизительно 1: 10). Разведения можно готовить в воде или жилкой среде, рассевая затем по несколько капель ь пробирки с расплавленной агаризоаанной средой, либо последовательно использовать в качестве инокулята небольшое количество засеянной агаризованной среды (такоа посев надо проводить быстро, чтобы среда не успела застыть).
Существует нескслььг модификаций этого метола. Г!осле посева пробирки герметично закрывают резиновы:— ми пробками и помешают в люминостат. Через несколько дней в них мохсно увидет= отдельные окрагценные колонии. Для получения культур пурпурных несерных бактерий, многие из которых устой и.- вы к небольшим конпентрацилм кислорода, рекомендуют также посев петлей и.:: шпателем на поверхность агаризовапной среды в чашке Петри. Засеянные чашки помещают в люминостат и инкубируют в атмосфере воздуха либо помещают в анаэросгзг из прозрачного стекла и инкубируют при освещении в атмосфере„обогащенной 5-: СО, и 3 % Нь На поверхность агарпзованной среды можно также разложить фильтрь: на которых сконцентрированы пробы исследуемой воды.
Отдельные колонии, выро.- шие на среде или на фильтрах, в дальнейшем используют для получения чистой кз-.ьтуры пурпурных несерных бактерий. Получение чистых культур. Наиболее эффективным методом для получен:. =. чистых культур фототрофных бактерий является их выделение из отдельнь изолированных колоний. Из пробирки извлекают столбик агаризованиой ср=- ды с выросшими в ней окрашенными колониями (обычно для этого у нее отпиливают дно и выталкивают агар, вместо пробирок удобно также испо;ьзовать трубки Бурри), помещают его в чашку Петри и с помощью капилляр достают выбранную колонию.
Переносят колонию в стерильную пробир~- раздавливпот пипеткой, растирают на внутренней стенке пробирки и суспен— 230 дируют бактерии в небольшом количестве среды. Суспензию используют в качестве инокулята для засева серии пробирок с агаризованной средой, как описано выше. Все операпии проводятся в боксе или ламинарном шкафу со строгим соблюлением условий стерильности. Выделение культуры из отдельной колонии обычно повторяют несколько раз, обязательно проверяя культуры на чистоту как микроскопированием, так и высевом в питательные среды, в частности, в среду для сульфатредуцирующих бактерий.
Культуры фототрофных бактерий выращивают в люминостате, а хранить их можно при естественном освещении или в холодильнике. ГЛАВА 18 ВЫДЕЛЕНИЕ И УЧЕТ ГРИБОВ МЕТОДАМИ ПОСЕВА НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ПРИМАНОК 18.1. ОТБОР ОБРАЗЦОВ ПОЧВ И РАСТЕНИЙ Важную роль при проведении микологического анализа почв и растений играет отбор проб. Процедура отбора, хранения и транспортировки образпов должна гарантировать уверенность, что выделяемые на завершающем этапе работы грибы действительно являются обитателями данных почв. Для получения достоверной характеристики комплекса почвенных микроскопических грибов в биогеоценозах необходимо проведение нескольких анализов за вегетационный сезон (не менее трех) при достаточном в каждом случае числе повторностей для статисгической обработки резульгатов.
Почву анализируют, как правило, на основе 5 — 1О отдельно взятых образцов, отобранных методом случайных проб. В зависимости от цели работы образцы берут из верхнего минерального горизонта, пахотного горизонта (в случае агроценоза) или по горизонтам почвенного профиля. Для отбора образцов необходимо иметь стерильные пакеты из водопрочной бумаги или полиэтиленовые пакеты, этикетки, почвенный нож, лопату, спирт, вату, спички, полевой дневник и карандаш. Для взятия образца делается прикопка лопатой и затем почвенным ножом, протертым ваткой, смоченной спиртом, и обожженным в пламени, отбирается навеска, предсгавляющая исследуемый горизонт почвы нли подстилки. В полевых условиях возможна и более грубая стерилизация пожав путем предварительного многократного втыкания его в исследуемый горизонт.
При анализе грибов по генетическим горизонтам образцы берут начиная с нижнего к верхнему горизонту почвенного профиля„что уменьшает возможность внесения микроорганизмов в нижние слои из верхних. Каждую пробу (10 — 100 г в зависимости от целей работы) помещают в стерильный пакет, этикетируют и транспортируют в лабораторию в термостатируемом ящике. Образцы анализируют в день отбора.
Если образцы анализируются по истечении нескольких суток (до 3 — 4), то их в этот период хранят в холодильнике при 5'С. Долго хранить при положительной температуре влажные образцы нельзя, так как в них меняются биомасса и соотношение различных групп 231 микромицетов. Такие образцы хранят в замороженном состоянии в холодильнике. Аналогичным образом хранят образцы растительных остатков и надземных частей растений. Если нет возможности произвести анализы свежих образцов и хранить в холодильнике, их необходимо быстро высушить до воздутгшо-сухого состояния при температуре не выше ЗО'С, не подвергая воздействию солнечных лучей. Для проведения анализа корней и ризосферной почвы растения отбирают вместе с монолитом окружающей их почвы. Для сравнения берут образцы контрольной почвы (из междурядий или с аналогичного по почвенным свойствам участка без растительности).
Подготовку почвы и анализы необходимо проводить в день отбора проб. Удаляют болыпие комки, оставляя только ризосферную почву — слой почвы вокруг корней до 3 — 5 мм. 18.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ, ВИДОВОГО СОСТАВА И СТРУКТУРЫ БИОТЫ МИКРОМИЦЕТОВ В ПОЧВАХ И ДРУГИХ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДАМИ ПОСЕВА НА ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Точность анализа в значительной степени зависит от использованных методических приемов. Для определения численности, видового состава и структурьт комплексов микроскопических грибов производят посев из разведений почвенной суспензии. Предиоеевиая обработка образцов. Учет мицелиальных микроорганизмов на питательных средах имеет более условный характер по сравнению с учетом бактерий и дрожжевых грибов, так как здесь более неопределенными являются величина и характер пропагулы, давшей колонию.
Это могут быть различные гспсративные образования, фрагменты пзф, разнообразные мицелиальные структуры. Предварительная обработка дает возможность разбить тифы на куски, размер которых хотя и продолжает различаться в несколько раз, но уже не в десятки и сотни, как это было до диспергирования почвы. При подготовке почвы для посева разведений необходимо разрушить почвенные агрегатьь десорбировать споры и мицслий с поверхности почвенных частиц, дезагрегировать скопления спор и разбить гифы на достаточно однородиыс по размерам жизнсспособные фрагменты.
Эти цели достигаются механическими и химическими воздействиями. При учете грибов целесообразно использовать пропеллерную мешалку. растирание почвенного образца, увлажненного до пастообразного состояния, или интенсивное встряхивание почвенной суспснзии. При нсэнергичном перемешивании суспензии в колбах на качалке почвенные агрегаты совершают плавное поступательно- вращательное движение и не подвергаются существенному диспергироваиию. Грибы больше, чем бактерии и актиномицеты, страдают от жестких способов обработки почв. Так, при учете почвенных грибов улыразвуковая обработка оказывает явно отрицательное действие. Известно, что чем крупнес клетка, тем больше она повреждается ультразвуком.
Крупныс клетки грибов повреждаются ультразвуком сильнее, чем мелкие клетки бактерий. При использовании ультразвуковой обработки, применении алкилсульфата и щелочи определяемое посевом количество грибов часто нс увеличивается, а иногда даже уменьшается. 232 Эффективность предпосевных обработок зависит от свойств почвы и наиболее действенны они при работе с сухими образцами в сравнении с влажными или замороженными. Проведение обработки. Почвенную суспензию (1 — 10 г почвы на 100 мл стерильной водопроводной воды) обрабатывают путем 15 — 20-минутного встряхивания в колбах на качалке (100 об/мин) или на пропеллерной мешалке-миксере (микроразмельчитель тканей РТ-2) с предварительным растиранием почвы, увлажненной до пастообразного состояния пестиком с резиновым наконечником в фарфоровой ступке.
Время обработки на микроизмельчителе тканей — 3 — 5 мин при 5000 об/мин. Затем готовят нужное лля посева разведение. Стержень и пропеллер мешалки тшательно очищают от почвенных частиц механически. Далее стержень протирают спиртом, дают ему испаритьея и производят обработку новой пробы почвы. Стаканчики, в которых проводится диспергирование почвы, стерилизуют в автоклаве или спиртом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
