А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 73
Текст из файла (страница 73)
При характеристике микромицетного населения почв часто используется понятие комллекси, которое подразумевает совокупность популяций разных видов микроскопических грибов, обитающих в почве или другом компоненте экосистемы (Т.Г. Мирчинк, 1988). При описании структуры комплекса грибов изучаются состав и представленность видов, т. е. в отличие от изучения структуры сооб|цеств не выявляются функциональные (трофические и регуляторные) связи между видами. При этом исходят из того, что участие грибов в круговоротах веществ в природе обычно тесно взаимосвязано с другими организмами. Вместе с тем, при наличии признаков взаимодействия видов (или его возможности) вполне правомочно характеризовать биоту сапротрофных микроскопических грибов в данном местообитании как сообщества. Оценку представленности микроскопических грибов в почвах и других компонентах наземных экосистем проводят на основе показателей обилия (доля колоний данного нида от общего числа колоний в посеве исследуемого объекта), временнбй частоты встречасмости (число моментов времени, когда вид обнаружен, от общего числа сроков анализа) и пространственной частоты встречаемости видов (доля индивидуальных образцов, в которых вид выявлен от общего числа проанализированных образцов).
Типичными для изучаемого местообитания считают виды с временнбй частотой встречаемости нс менее 30% (Т.Г. Мирчинк, 1988). При сравнительном анализе комплексов грибов в различных компонентах биоценозов необходимо использовать данные, полученные при сходных методических подходах, в частности при посевах на одни и те же среды — с легкодоступными углеводами (среды Чапека, Мартина, ролана, сусло-агар), с целлюлозой (среда Гетчинсона и «голодный агар») и равном числе образцов из каждого местообитания.
Для характеристики и сравнения комплексов микроскопических грибов в разных местообитаниях применяют экологические индексы — индексы разпо- 242 зоразия и выравненности Шеннона, доминирования Симпсона, коэффициент сходства Серенсена; рассчитывают соответствие различным моделям рангового распределения относительного обилия видов, среднюю радиальную скорость роста типичных видов и некоторые другие показатели (Т.Г. Мирчинк, 1988; Д.
Г.Звягинцев, 1991; Э.Мэгарран, 1992; А.В. Кураков, 2001). 18.3. МЕТОДЫ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ БОЛЕЕ ПОЛНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ РАЗНООБРАЗИЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ Существуют специальные приемы предпосевной обработки и предынкубации почв и водно-почвенных суспензий, позволяющие более детально охарактеризовать видовой состав и выделить отдельные группы грибов в почвах. Методы прямого посева мелкозема иа питательные среды.
Для более полного прелставления о микобиоте почвы рекомендуется производить посев почвенных частиц, рассыпая их по поверхности агара, что дает возможность сулить о количестве микроколоний и качественном составе грибов. Предпосевная обработка почв в этом случае сведена к минимуму. Для выделения грибов методом прямого посева из средней пробы образца стерильным ланцетом берутся небольшие навески почвы (от 20 до 200 мг в зависимости от плотности грибных популяций в почве) и равномерно наносятся на поверхность питательных сред. Существует прием, когда стерильным пинцетом переносят точно взвешенные навески мелкозема почвы (5 — 50 мг) в стеклянную трубку или маленькую воронку, затянутые снизу сеткой из мельничного газа с диаметром пор 0,25 мм.
Навеску просеивая>т через сетку„равномерно распределяя почвенные частицы по поверхности агаризованной питательной среды, Из каждого отдельно взятого образца делают высев на 3 — 5 чашек Петри. При посеве мелкозема на богатые среды — сусло-агар, среды Чапека и Мартина — навеска, как правило, не превьппает 5 — 20 мг, при посеве на бедные среды — водный и почвенный агар— аерут 50 мг почвы. Анализ состава грибов и выделение их в чистые культуры можно провести на 5 — 10-е сут на богатых средах и через 2 — 3 нед на бедных.
Для этого необходимо установить оптимальную для исследуемой почвы массу образца, чтобы на чашке Петри вырастало не более 15 — 25 колоний. Мелкозем можно также внести на дно стерильной чашки Петри, смешать с каплей стерильной воды, добавить охлажденную питательную среду и затем легкими круговыми движениями чашки частицы почвы равномерно распределить по всей ее площади.
В сравнении с методом разведений мы имеем дело с практически ненарушенными частицами почвы и получаем дополнительные возможности для выявления видового разнообразия грибов. Известен ряд близких к описанному методу способов посева почвенного мелкозема на питательные среды для выделения микромицетов: метод прямых отпечатков почвенной пробы и электростатический метод, — суть которых сводится к различным приемам нанесения почвезшых частиц на поверхность питательных сред. Сукцессионный и обогатительный подходы. Сукцессионный подход заключается в инкубировании почвы в течение 1 — 4 нед и более при различных 243 температуре, влажности, с обогащением почвы и без него различными соединениями (глюкозой, целлюлозой и лр.) и периодическим проведением посевов.
Инкубация образцов после их увлажнения с добавкой или без добавки субстрата ведет к развитию и смене разных групп грибов (сукцессии) в ходе трансформации субстратов в почве, что позволяет более полно описать качественный состав грибов в изучаемой почве. Принцип накопительного подхода заключается в обеспечении благоприятных условий для роста грибов с определенными свойствами, что приводит к увеличению их численности в почве.
Следует, однако, учитывать, что при секреции внеклеточных ферментов в процессе разложения субстрата, применяемого в качестве селектируюшего фактора для конкретной группы грибов, продукты их ферментативного гидролиза могут бы гь использованы и другими микроорганизмами. Поэтому важно выявить ранние стадии повышения плотности популяций грибов, интересующих исследователя. Так, при внесении фильтровальной бумаги и инкубации увлажненной почвы при температурах более 45 С в период 7 — 14 сут можно добиться преимущественного развития целлюлозолитических и термофильных микромицетов. Индукция прорастания пропагул.
Для повышения разнообразия выделяемых видов целлюлозолитических микромицетов в качестве индуктора можно использовать добавку целлобиозы (0,3 — 30 мМ)„Ю-сорбозы (0,05 — 2 мМ), арабинозы (0,05 — 0,5 мМ) или лактозы (О,1 — 2,0 мМ) в водно-почвенные суспензии за несколько часов до посева на агаровые среды с микрокристаллической или аморфной целлюлозой. Прием основывается на том, что невысокие концентрации этих соединений могут индуцировать синтез целлюлаз у микроорганизмов. Методы водной отмывки почвенных частиц.
Промыванис или отмывка почвенных частиц, корней, различных растительных остатков представляют собой приемы снижения в посевах колоний обильноспороносящих видов грибов и повышение числа видов, находящихся в мицелиальном состоянии. Сущность метода составляет проведение серии промываний почвы или многократных смывов с корней стерильной водой в целях удаления максимально возможного количества спор. По завершении процедуры почвенные частицы помешают на стерильную фильтровальную бумагу для устранения избытка воды и затем их раскладывают на агаровые среды (по 2 — 4 частицы на чашку Петри). Оптимальное число промываний и их продолжительность для достижения эффективного удаления спор должно определяться в предварительных экспериментах.
Промывка почв может проводиться простыми приемами (на качалке с последовательной заменой воЛы) и с использованием специальной аппаратуры. Они основаны на инструментальном разделении почвенных частиц на фракции разных размеров с дальнейшим суспендированием их в стерильной воде.
Существуют различные модификации специальных аппаратов для такого отмывания почвенных частиц. Принцип их конструкции — наличие внутри полости аппарата нескольких закрепленных сит с отверстиями разного диаметра. наверху — с более крупными, а ниже — с более мелкими. Проба почвы помещается на поверхность верхнего сита, а затем через аппарат пропускают порции воды. Образец почвы (20 г) помещают в аппарат на верхнее сито (размер отверстий 1,5 мм).
Плотно закрывают прибор пробкой. Через отверстие в проб- ке заливают аппарат наполовину водой. Скорость потока воды составляет 1,5 л/мин. Промывную воду собирают в ведро. Первоначально можно использовать 4 л водопроводной воды, а затем 2 л стерильной воды. После отмывания аппарат открывают и почву, которая аккумулировалась на нижнем сите (с порами 0,5 мм), переносят в стерильные чашки Петри с неболыпим количеством воды. Органические частицы, которые всплывают на поверхность, собирают первыми при помощи тонкого пинцета, помещают на стерильную фильтровальную бумагу, а затем переносят по 4 частицы на чашку на кукурузный агар или почвенный агар с добавлением антибиотиков. В пробу сливают супернатант и минеральные частицы обрабатывают таким же образом.
Результаты могут быль подсчитаны для каждого вида гриба как процент от общего числа частиц или обиднего числа изолятов. Первый метод дает сравнительную оценку грибной плотности для отдельных почв — «коэффициент колонизацииэ. Сравнение результатов для различных почвенных образцов может проводиться только для почв, сходных по структуре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
