А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Эффективность водных промывок связана с физическими свойствами почв (легче промыть песчаную почву, чем тяжелосуглин истую). Тепловая обработка почв. Образцы увлажненной почвы или водно-почвенной суспензии выдерживают в термостате при температуре 60 — 80 С в течение нескольких часов или на водяной бане в течение 10 — 30 мин с последующим быстрым охлаждением в тающем льде. Эффективность обработки можно усилить, погрузив образец почвы на 6 — 8 мин в 60%-й этанол, а затем приготовить суспензию и прогреть ее, как сказано выше.
Можно образцы почвы прогреть паром при 60 — 65 'С в течение 30 мин и затем высевать на агаризованные питательные среды. Тепловукз обработку в течение нескольких часов (до 12 ч) можно провести и уже засеянных методом разведений или (что эффективнее) мелкоземом агаризованных сред в чашках Петри. Эти приемы используют для изолирования термотолерантных грибов и индукции прорастания спор (например, аскоспор у сумчатых грибов). Фумигация почвы.
Метод рекомендуют для выделешгя сумчатых грибов. Для фумигации чаше всего используют формалин, метилбромид, хлороформ, пары которых легко диффундируют в исследуемые образцы и могут быстро удаляться из них проветриванием. Просеянную почву (2 — 4 мм) помещают в стеклянную трубку с несколькими боковыми отверстиями, вводят через них нужную дозу фумиганта и закрывают резиновыми пробками. Через несколько часов экспозиции резиновые пробки заменяют на ватные. Обработку почвы парами хлороформа можно провести в эксикаторе аналогично процедуре фумигационного метода определения микробной биомассы.
Фумигация почвы этими веществами в определенной дозе не убивает аскоспоры многих видов родов ТЫе1ата, С)шеготшт, ЯоЫппа„телеоморф аспергиллов и пенициллов. Дозировка и время экспозиции зависят от типа почвы и вида гриба и подбираются экспериментально. Так, виды из песчаной почвы выделяют после ее обработки метилбромидом в течение 4 ч в дозе 0,6 мл на 1000 мг почвы. Метод флотации. Метод применяется для учета и выделения из почвы грибов родов В~роlап~, Ситти!апа, Ргес(ы1ега, ЕхзегоЫ/ит и др., которые имеют крупные споры. ! — 10 г почвы суспендируют в 90 мл стерилизованной воды и добавляют 5 — 10 мл стерильного вазелинового или другого минерального масла. Колбы помещают на качалку (150 — 180 об/мин) на 1 — 6 ч.
После взбалты- 245 вания суспензии лают отстояться и с помощью стерильной пипетки берут несколько капелек из поверхностной масляной пленки для учета в камере Горяева и посева на ггитательные среды для выделения грибов в чистые культуры. Эмульсия, собирающаяся на поверхности воды, содержит большую часть спор, имеющихся в почве. Центрифугировапие водно-почвенной суспензии. Метод центрифугирования лает возможность изолировать пиреномицеты, имеющие крупные споры (Огаеготгииг тигогит, С. агера1осаграгг, хогг(апа/1тгса)а и др.), многочисленные стерильные изоляты„хламидоспоры фузариев.
Почву прелварительно просеивают через сито 2 мм, затем образец массой 1О г взбалтывают энергично в 100 мл стерильной воды, отстаивают 30 с и сливают надосадочную суспензию, осадок удаляют. Процедуру повторяют 4 раза, что позволяет удалить песок и другие крупные частицы. После этого взвесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин. Осалок переносят в 20 мл стерильной воды, взбалтывают, отбирают 10 мл и пропускают через колонку с растворами сахарозы. Затем цеытрифугируют 30 мин при 350 об/мин лля освобождения от минеральных частиц. Олин объем суспензии разбавлякгт тремя обьемами стерильной воды и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.
Полученный осадок переносят в пробирку с 3 мл стерильной воды и засевают по 0,25 мл в чашку Петри на агаризованную среду. УФ-облучение. Метод применяют лля выделения темноокрашенных грибов. Засеянные почвенной суспензией или мслкоземом чашки Петри облучают ультрафиолетовыми лучами в течение 15 — 240 с.
Облучение чашек Петри в течение 15 с уменьшает количество грибов на 20%, 240 с — на 50 %. Уменьшение количества выросших колоний происходит за счет гибели грибов с палевыми и тонкостенными спорами (вилы родов Релгсг//гит, АзрегрПие, 3Иисаг). Предложена методика, позволяющая подавлять развитие быстро- и широкорастуших грибов порядка Мпсога!ез и семейства МпсеЖпасеае, стимулировать развитие видов родов Аеггегр)(ие, /"изаиит, не измепгш состава выявляемых темноокрашенных гифомицетов. Для этого почвенную суспензию в разведении 1: 10 разливают в пробирки по 5 — 8 мл и облучают при постоянной интенсивности дозой т-лучей 100 крад. Разведение лля посева из облученных образцов на 1 — 2 порядка ниже, чем в случае необлученных проб.
18.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ГРИБОВ, НАХОДЯЩИХСЯ В АКТИВНОМ СОСТОЯНИИ И РАЗВИВАЮЩИХСЯ НА РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ В ПОЧВЕ 18.4.1. Выделение грибов„находящихся в мицелиальной Форме Метолы прямого выделения гиф грибов пз почвы. Небольшие образцы почв (почвенных агрегатов) насыщакгт стерильной водой и аккуратно разбивают тонкой струей воды. Удаляют тонкодисперсную часть взвеси суспензии и крупные минеральные частицы. Повторяют эту операцию в целях получения фракции 246 тяжелых почвенных частиц, которые распределяют в тонком слое стерильной зоды и просматривают в стереоскопическом микроскопе для обнаружения гиф. Существует прием по отделению гиф от почвенных частиц путем фильтрации через фильтр с порами 50 мкм.
Отдельные гифы переносят в капле стерильной воды на кончике препарозальной иглы под контролем микроскопа в стерильные чашки Петри и затем наливают расплавленную, но охлажденную питательную среду. Можно переносить фрагменты гиф непосредственно на поверхность застывшей питательной агаровой среды и отмечать маркером на обратной стороне чашки место цнокуляции. Проводят ежедневные наблюдения под микроскопом, чтобы быть уверенными в том, что рост грибов начался из посеянной гифы.
Метод почвенных отмывок. Этот метод описан в предыдущем разделе. В связи : тем, что процедура водных отмывок направлена на удаление спор с почвенных частиц, он может также использоваться для вьшеления грибов из мицелия. Иммерсиовиые методьк Для выделения грибов, присутствующих в почве в виде растущего мицелия, в почву помещают специальные пробирки или стекла с водным агаром или другой средой (трубки Честерса, стекла-ловушки ЛяТуш, экранированные стекла Торнтона, пластинки с ячейками), которые, согласно конструктивному решению, имеют воздушный промежуток между средой и почвой. Наличие воздушного зазора дает преимущество в заселении среды активно растущим в почве гифам грибов.
Один из наиболее простых методов заключается в использовании пластиковых автоклавируемых пробирок„в стенках которых делахзтся отверстия (диаметр 0,25 см), пробирки обматывают пластиковой лентой, заполняются питательной средой (воздуп1ный зазор сверху 4 см), закрывают пробкой и автоклавируют. Перед закладкой в почву большой стерильной иглой прокалывают отверстия в ленте напротив уже имеющихся в пробирках и помещают в почвенном образце или желаемой позиции почвенного профиля обычно на 5 — 7 дней.
Пробирки затем осторожно достают из почвы и в лаборатории вырезается сердцевина агара из каждой пробирки, делится на небольшие кусочки, которые помещаются на выбранную среду для выделения грибов. 18.4.2. Методы приманок Для выявления микроскопических грибов, развивающихся на различных субстратах в почве, применяют методы приманок, в качестве которых в почву помешан>т различные соединения, растительные или животные субстраты. Эти методы широко распространены в фитопатологии и почвенной микологии. В последние десятилетия методы приманок применяют для выделения грибовлеструкторов промьппленных материалов.
Они используются как в полевых, так и в лабораторных исследованиях. Выделение целлюлозоразлагающих грибов в полевых условиях. Стерильное хлопчатобумажное полотно, фильтровальную бумагу, целлофан, прикрепленные к стеклянным пластинам (аппликационный метод), погружают в почву на необходимую глубину, предварительно сделав прикопку или разрез. После определенного периода инкубации (от нескольких дней до месяцев) пластинки осторожно извлекают из почвы, просматривают целлюлозный субстрат под 247 бинокулярной лупой и появившиеся грибы (мицелий, репродуктивные структуры) отсевают с помощью препаровальной иглы на агаризованные питательные среды.
При закладке пластинок в достаточной повторности можно исследовать динамику заселения различными грибами целлюлозы и их состав при различных погодных условиях. Существует способ изучения состава грибов на целлюлозе с последующей «проявкой». Стерильные куски фильтровальной, крафтовой бумаги или целлофана размером 5 х 5 см закрепляли в диапозитивных рамках для проектора и помещали вертикально в соответствующий горизонт исследуемого почвенного профиля. Повторность для кахогого варианта нс менее трех раз.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
