А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 77
Текст из файла (страница 77)
Вместо раскладывания корней на агаризованных питательных средах можно поместить их в стерильный увлажненны~ песок на 2 — 4 нед и затем обнаруженные грибы (при необходимости под контролем микроскопа) перенести на питательные среды. При посеве ризосферной почвы и выделении сапротрофных грибов с корней используют различные срелы: сусло-агар, среды Чапека, Мартина, глюкозопептонные и среды, приготовленные на растительных отварах, — овсяную, картофелную и др. Инкубируют чашки при температуре 24 — 26 'С в течение 1 — 3 нед.
Для изоляции фитопатогенных видов применяют различны= селективные среды, состав которых зависит от вида изучаемого патогена. Все методы, описанные для выделения грибов с корней могут быть использованы для изучения микобиоты надземных частей растений и растительны: остатков на различных стадиях разложения. Глава 19 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИИ ПРОСТЕЙШИХ Простей~пне (Рпэ1огоа, протисты) — богатая по видовому составу (до 200 тыс видов) группа одноклеточных животных, распространенных повсеместно.
Он; встречаются в различных географических условиях, заселяя океаны, моря пресные и солоноватые водоемы, почву. Очень многие простейшие от свобол— ного образа жизни перешли к обитанию в других организмах и стали симбиоитами или паразитами.
Простейшие лишены клеточной стенки (хотя нскоторы имеют панцирь) и поглощают питательные вещества абсорбцией через клеточную мембрану или путем энлоцитоза. Для простейших наиболее характернь. гетеротрофный и миксотрофный типы питания; облигатных автотрофов, повцдимому, нет. Обычной пищей свободноживущих протистов служат водоросли, бактерии, дрожжи, разлагающийся опал и остатки микроорганизмов, также другие простейшие и мелкие членистоногие. Размножение простейшк осуществляется половым и бесполым путями, иногда оба способа воспроизводства составляют стадии единого жизненного цикла организма. Простейшие играют значительную роль в продукции и деструкции оргашэ ческих веществ, в цепях питания животных. Велика их роль и в разложенп: органических загрязнений при биологической очистке сточных вод и самооч|- щении водоемов.
Возможно использование биомассы простейших в качеств- нового источника кормового белка. Некоторые представители Ргогохоа продг- 254 цируют ценные биологически активные вещества. В то же время многие паразитические простейшие являются возбудителями тяжелых заболеваний человека, животных и растений. 19.1. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОЧВЕННЫХ ПРОСТЕЙШИХ Почвенные простейшие колонизируют разнообразные типы почв, но наибольшее богатство видов и высокая их численность характерны для почвы лесов. В 1 г почвы содержится от десятков до сотен тысяч простейших, которые представлены жгутиконосцами (Маз11йорЬога), саркодовыми (эагсог)1па) и инфузориями (1п)пзог)а, С!Вага).
наиболее распространены жгутиконоспы родов елл!егга (фитомастигины)„лтслаь Вог1о, Сегсолюлсз, О!сетовал (зоомастигины). Среди саркодовых в почве встречаются корненожки: голые амебы представлены родами Атоеьа, Оуи1одасяж !УагХ1ег1л„ 1га!П!гал1рфа, раковинные — родами Сеп!горух1тч Р1аягорухЬ, 2геве1а, 011!!ялга, Агсе!!а, Согугл!огь Еифур1ш, Т~нета. Почвенные инфузории — это в основном виды рода Со!рог!а, а также некоторые вгщы Нурсгг!гЬл!а и РгсхгоглагЫа.
Для простейших характерны разнообразнос морфологическое строение и значительное отличие по физиологическим функциям. В связи с этим необходимы различные приемы и способы их исследования. На сегодняшний момент предложено множество методов прямого подсчета почвенных протистов, предназначенных для выявления находящихся в почве простейших без их предварительного размножения. Однако прямым подсчетом удается обнаружить лишь немногих почвенных простейших и не вссгдгь поэтому широко используются методы количественного учета, требующие предварительного размножения простейших. Таким образом, все способы обнаружения простейших в почве могут быть сведены к двум основным: 1) прямое обнаружение в почве пли почвенной суспензии; 2) косвенное обнаружение в различных питательных средах, в которые были внесены пробы почвы. Несмотря на то что большинство методик было разработано ловольно панно, они не утратили своей актуальности и в настоящее время.
19.1 1. Определение количества простейших, обнаруженных непосредственно в почве Подсчет простейших в почвенной суспензии проводят методами количественного учета, принятыми в микробиологии. Наиболее прост, хотя и несовершенен, следующий метод. Почву, смешанную с небольшим количеством воды, помещают на предметное стекло с лункой и сразу же микроскопируют. Для замедления движения быстродвигающихся Форм и их подсчета добавляют 1— 2 %-й раствор желатины или 0,001 % агара.
Недостатком этого метода является то, что с его помощью учитывают только свободноплавающих простейших и не учитывают всю массу организмов, оставшуюся среди почвенных частиц. Необходимо иметь в виду, что некоторые простейшие при смачивании быстро (через несколько минут) выходят из цист и, следовательно, для обнаружения активных Форм пробу почвы нужно просматривать незамедлительно. Этим способом улается обнаружить главным образом крупные Формы активных простейших при условии их высокой численности в почве. Сравнительно легко различимы раковинные корненожки.
255 Для учета раковинных амеб используют микроскопирование водной суспснзии почвы. Для этого к навсске почвы (0,1 г) добавляют 20 — 25 мл воды, оставляют на несколько часов ло размокания почвенных частиц и взбалтывают в течение 10 мин. Дно стерильной чашки Петри расчерчивают по трафарету на квадраты 1х1 см. В приготовленную чашку выливают полученную суспензию, распределяя мслкозем по дну чашки тонким слоем. Крупныс комочюг почвы разрушают препаровальной иглой. Взвесь микроскопируют с объективами Вх или 40х. Число раковинок полсчитывают по диагонали в 14 квадратах, расположенных крестообразно. Общее количество амеб (М) в навеске определяют по формуле Ы = (Ф/14) 5, где Ф вЂ” число раковинок в 14 квадратах; о — плошадь лна чашки.
После фиксации микроорганизмов на предметном стекле можно использовать окраску карболовым эритрозином (рсцепт красителя см. в приложении 5). В результате живые амебы окрашиваются в интенсивно-малиновый цвет, а их пустые раковинки— в розовый. 19.1.2. Обнаружение и подсчет почвенных простейших с использованием питательных сред Принцип косвенных методов заключается в предварительном культивировании почвенных простейших в питательной среде, для чего в стерильную среду вносят навеску почвы, взятую из естественных условий. Среда должна быть также благоприятной и для развития бактерий, которыми питаются простейшие. Считается, что в жидких средах лучше развиваются инфузории и жгутиконосцы, а на плотных срелах — амебы. Метод проращиваиия почвенного мелкозема во влажных камерах иа агаризоваиных покровиых стеклах.
Для этого метода необходимо приготовить водную почвенную вытяжку (! кг почвы/л воды), которую затем кипятят 1 ч. отстаивают в течение суток и фильтруют. К полученному фильтрату добавляют 1% агара, очищают белком куриного яйца (см. гл. 3) и наносят тонким слоем на обезжиренные покровные стекла.
Стекла помещают на влажную фильтровальную бумагу в чашки Петри. Почву размельчают и просеивают через сито 0,25 мм; почвенный мелкозем через трубку, один конец которой закрыт сеткой, равномерно высевают на поверхность агара на стекле. Чашки инкубируют при 20 — 24'С в течение 7 — 10 сут.
Этот метод позволяет наблюдать за развитием и активным движением простейших и з)1и, а также вьщелять их в чистую культуру. Для окрашивания стекол молибдсновым гематоксилином (протрава — молибдсново-кислый аммоний МоО„()ЧН4)ь гематоксилин — 0,5%-й водный раствор) хгикроорганизмы необходимо предварительно зафиксировать, для чсго стекла помещают в царь. ! %-и осмисвой кислоты на 1 — 2 мин или в жидкость Шаудина (приготовление реактива см. в приложении 6).
Эксперимент проводят в 10-кратной повторности. Учитывая площадь стекла, поля зрения микроскопа и вес почвенного мелкозема, вычисляю- количество протистов в 1 г гючвы. Особенно хорошо этим методом учитываются амебьс Метод предельных разведений. Навеску почвы разводят жидкой питательной средой. Далее проводится математическая обработка полученных результатов пс таблице Мак-Креди (см. гл.
7). Этот метод используют для количественного учет; 256 активнодвигаюшихся простейших. Увлажняют 10 г почвы до пастообразного состояния стерильной питательной средой из сенного отвара с почвенной вытяжкой 1: ! !рецепты см. в приложении 4) и растирают 5 мин в фарфоровой ступке резиновым напалечником. Затем готовят ряд последовательных 10-кратных разведений (не менее пяти). Для каждого разведения берут по три пробирки с 9 мл среды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
