А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 79
Текст из файла (страница 79)
гл. 7) и бактерий (методом предельных разведений или измеряя оптическую плотность культуры, см. гл. 7). Затем в каждую пробирку с развивающимися бактериями вносят по 2 мл культуры простейших. Культивирование проводят при 26 С. Интенсивность развития простейших оценивают в динамике в течение недели и выражают в процентах, принимая за 100 % рост протистов на олигонитрофильных микроорганизмах. Количественный учет простейптих П15ОВОдят мик150скОпически.
Для наблюдения за питанием простейших дрожжами готовят густую суспепзию дрожжей (Юаее55агаи5уеез ее5еиееае) в стерильной водопроводной воде, которую затем по трафарету наносят штрихами длиной 2 см в двойной повторности на поверхность «голодного» агара (15,0 г агара на литр водопроводной воды) в стерильные чашки Петри. В конец каждого штриха ннокулируют цисты и вегетативные клетки амеб. Наблюдения проводят на 3 — 4-е сут, отмечая степень выедания штриха дрожжевых клеток амебами, а также ннцистирование амеб. Необходимо учитывать, что иногда амебы инцистируются до того, как выедают штрих полностью. Возможно также использование другого способа наблюдения за питанием простейших. Он заключается в том, что в большие пробирки наливают по ! мл стерильного физиологического раствора, в который вносят смешанные культуры различных дрожжей и амеб. Стерильно отбирают пипеткой кагшю смеси и помещают в камеру Горяева для отлельного подсчета клеток амеб и дрожжей под микроскопом.
Пробирки инкубируют при 25 'С. Подсчеты делают через каждые 12 ч, учитывая изменение числа дрожжей, всгетативных клеток и цист амеб. Для микроскопического наблюдения за питанием простейших несколько инфузорий (Рагаи5ее5ии5 сиие(агиа5) отсаживают на часовое стекло в стерильную питательную среду (см, приложение 4). Через 1 ч, в течение которого инфузории освобождаются от имевшихся пищевых вакуолей, в среду помешают суспензию чистой культуры бактерий.
Через 30 мин под бинокулярным микроскопом (увеличение 8х) простейших вылавливают капилляром из часового стекла и помещают на предмепюе стекло. Для замедления движения инфузорий в прижизненный препарат добавляют 1 — 2%-й раствор агара и подсчитывают вакуоли при увеличении 40х. Для фиксации парамеций используют пары ледяной уксусной или осмиевой кислоты. При этом предметное стекло с каплей, в которой находятся инфузории, перевернув вниз, держат над парами кислоты в тече- 261 ние ! мин. Вместо бактериальной культуры можно также использовать суспензию туши, каплла которой вносят в питательную среду простейшллх. Вакуоли, содержашлле черную тушь, хорошо видны прн малом увеличении микроскопа. Обнаружение пищеварительных ферментов простейших на примере кислой фосфатазы.
Для выявления кислой фосфатазы (маркерный фермент лизосом) перед фиксацией в течение 10 мин инфузорий кормят олигонитрофильными бактериями на среде из сенного отвара с почвенной вытяжкой (см. приложение 4). Затем простейших фиксируют 30 мин раствором Карновского на ледяной бане, четырехкратно (по 10 мин на холоду) отмывают 100 мМ Иа-ацетатным буфером (рН 5,5)„инкубируют в среде Гомори (рН 5,5) при 37'С на водяной бане в течение 25 мин. Среда Гамора (готовятся в день использования!): 0,06 г нитрата свинца растворяют в 45 мл Ха-ацетатного буфера (100 мМ, рН 5,5).
Затем при помепливании добавляют по каплям 10 мл 3%-го раствора Ха в глицерофосфате (субстрат) и доводят водой до 90 мл. Доводят рН до 5,5 с помощью 10%-й уксусной кислоты. Готовый раствор хранят при 37 С (в термостате). Перед инкубацией проверяют рН среды и, если нужно, доводят до 5,5; затем доводят объем до 100 мл водой и фильтруют через бумажный фильтр. Контролем служит среда Гомори, содержащая 10 мМ ИаЕ Клетки трижды отмывают от среды в !00 мМ Иа-ацетатном буфере при комнатной температуре (по 10 мин), затем осаждают непрореагировавший нитрат свинца в виде РЬВ с помощью 0„5 %-го сульфида аммония.
Обработку проводят не более 1 мин, после чего клетки дважды промывают водой. Опытный и контрольный варианты микроскопируют. Следует иметь в виду, что после каждого этапа обработки суспензию клеток центрифугируют, а надосадочную жидкость осторожно отсасывают. Во время инкубации при 37 С и рН 5,5 (оптимумы температуры и рН кислой фосфатазы) от субстрата (1хла в глицерофосфате) с помощью кислой фосфатазы отщепляется РОлз, который немедленно осаждается нитратом свинца в виде фосфата свинца, тем самым предотвращается диффузия фосфата из мест ферментной активности.
Выпавший белый фосфат свинца виден только при электронной микроскопии, поэтому для световой микроскопии фосфат свинца нужно перевести с помощью сульфнца аммония в хорошо видимый черно-коричневый сульфид свинца. В контрольной среде 1хаР блокирует расщепление субстрата, так как ингибирует все активные в кислой среде ферменты. 19.1.5. Видовое определение простейших Видовому определению простейших предшествуют: выделение их в чистую культуру, морфологическое описание вегетативных форм, стадий покоя и цист, развивающихся на агаризованных и жидких средах, приготовление прижизненных и постоянных окрашенных препаратов.
Выделение чистых культур простейших. Для этого их выращивают на культуре олигонитрофильных бактерий, затем втягивают в стерильную пипетку или капилляр, после чего проводят через ряд (не менее 5) часовых стекол с питательной средой. После очистки культуры простешпих помещают в чистую культуру бактерий.
262 Можно применять и другой, более удобный способ получения чистых культур простейших. Расплавленную агаризованную среду разливают в стерильные чашки Петри, инокулируют одним из видов бактерий, располагая их в виде креста. В центр помещают простейших или частицы почвы с простейшими. Последние мигрируют к концам крестообразной колонии бактерий. После 2— 3 пересевов имеют полное освобождение простейших от всех сопровождавших их ранее бактерий, за исключением посеянной микробной культуры.
Видовое определение простейших проводят при их микроскопировании и выделении клоповых культур, которые поддерживают на жидкой и плотной питательных средах. Для идентификации обнаруженных форм готовят препарат «раздавленная капля». Движение инфузорий и жгутиконосцев замедляют 1 — 2%-м раствором желатины или агара. Для прижизненного окрашивания применяют водные растворы метиленового синего, метиленового зеленого и нейтрального красного.
Работу ресничек, жгутиков и пищеварительных вакуолей наблюдают в слабых разведениях туши. Для фиксирования и выявления цитологических структур объекты обрабатывают парами осмиевой кислоты ! — 2 мин (1%-й водный раствор ОзОч) или фиксатором П1аудипа (приготовление реактива см. в приложении б). Ядро выявляется при окрашивании 0,1%-м раствором метиленового зеленого в 1%-й уксусной кислоте (фиксатор Роскина). Реснички и жтутики окрашивают йодной тинктурой (несколько капель настойки йода в 10 мл воды). При прибавлении 2 — 4%-го раствора соды рельефно выступают ресничньгй аппарат, различные эктоплазматические образования, строение рта и глотки.
Все обнаруженные формы инфузорий, жгутиконосцев и амеб, их цистьт зарисовывают. Рисунки выполняют с живых объектов при увеличении микроскопа — 900» и 1500х. Для распознавания трофически акгивных стадий вегетативных клеток очень важно появление жгутиконосных форм в жидкой среде. Безошибочно отличить амебовилные стадии жгутиковых от амеб можно при исследовании форм в «висячей капле» во влажной камере„где формируются плавающие стадии жгутиконоспев. Однако одних лишь морфологических признаков недостаточно лля точной видовой идентификации, поэтому большое внимание уделяется и тонкому цитологичесому строению протозойных клеток.
Для этого готовят постоянные окрашенные препараты по методу Добелла„выявляют особенности кариокинеза на препаратах, обработанных по Фельгену и др. (точное описание этих методов можно найти в специальных руководствах). РАЗДЕЛ 1Ч ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИИ И МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ Глава 20 ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ПЛАНИРОВАНИЯ МНОГОФАКТОРНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА ПРИ ОПТИМИЗАЦИИ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ Методы математического планирования эксперимента нашли широкое применение для подбора питательных сред в целях повышения выхода биомассы или накопления определенных продуктов обмена вешеств микроорганизмов.
Они позволяют не только олновременно и~"бить действие нескольких факторов на интересуюший нас процесс, но и количественно оценить степень этого влияния. бюбЮж ~~ «б Риб РЮ, б печивающих максимальное накопление биомассы исследуемого вида. Практические занятия сопровождшотся курсом лекций, который знакомит студентов с различными типами планов многофакторных экспериментов и методами математической обработки их результатов. ЗАДАЧА.
ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ САПРОТРОФНЫМ ШТАММОМ РВЕУООМОИАВ АЕВУВIИОВА При постановке задачи оптимизации предполагается, что для изучаемого процесса выбран (на основании теоретических представлений или чисто практических соображений) показатель интенсивности этого процесса у, о котором заранее известно, что 1) он зависит от некоторого числа л переменных (факторов): х„хн хп ..., х„, т.е. существует функция (называемая функцией отклика): у = Лхпх2,хЗ,",х )1 2) эта функция имеет единственный максимум. Тогда решение задачи оптимизации сводится к нахождению этого максимума по всем и переменным. В теории эксперимента у назьгвакгг обычно параметром оптимизации, а переменные х, — факторами.
Вид функции у = /(хп хн хм ..., х„), как правило, неизвестен, и при экспериментальном изучении подобной зависимости для ее описания используют уравнения регрессии. В простей1пем случае, когда параметр у связан с каждым из факторов х; линейно, такое уравнение имеет вид: у = Ьа+ Ь| х1 + Ьтхт + ... + Ь„х„= Ьа + ~~ Ь,х;, (20.1) где коэффициенты Ь,, Ьь ..., Ь„характеризуют влияние каждого фактора на величину у. Нетрудно понять, что при увеличении х; на единицу значение у увеличивается или уменьшается на | Ь,! в зависимости от того, какой знак («+» или « — «) стоит перед членом Ь;х«Однако большинство биологических зависимостей имеет нелинейный характер и уравнение (20.1) может удовлетворительно («адекватно») описывать функцию отклика только в достаточно узкой области изменений х«Ясно также, что функция отклика (20.1) не имеет максимума.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
