А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 76
Текст из файла (страница 76)
Более точные расчеты можно провести, если после посева волно-почвенную суспензию отфильтровать через предварительно взвешенный фильтр, который сушат с почвой до постоянной массы и таким образом устанавливают массу ризосферной почвы. Ризосферную почву возможно собрать с корней, не прибегая к водным смывам, с соблюдением условий стерильности, осторожно удаляя ее с поверхности корней скюгьпелем и кисточкой. Затем почву взвешивают, и навески (не менее 0,5 — 1 г) вносят в колбы со 1ОО мл стерильной воды.
Несколько навесок используют для определения влажности почвы. Десорбцию микромиг !стев с почвенных частиц проводят на качюгке (!80 об/мин) в течение 15 мин, микроразмельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин или ультразвуковой установке до 2 мин. Для посева ризосфсрной почвы готовят серию разведений: ! Оз, ! О', !О', !О'. Для выделения микроскопических грибов, населяющих ризоплану (поверхность корней) и тех, что внедряются во внутренние ткани корня, разработаны следующие методические приемы. Методы водных смывов. Для изучения состава микромипетов, обитающих на поверхности корней, навески (не менее 0,5 — 1 г) кусочков корней (3 — 5 см) после удаления ризосферной почвы помец!ают в колбы со !00 мл стерильной воды.
Колбы встряхивают на качшлке (180 об/мин) в течение 5 — 10 мин. Затем корни с помо!пью стерильного пинцета или крючка переносят в следующую серию колб со стерильной водой и проводят дальнейшую лесорбцию грибов на 251 качалке. Проводят до 5 — 1О смывов с корней. Посев на питательные среды осуществляют из ряда последовательных смывов. Более жестким способом десорбции микроскопических грибов с корней является 1 — 5-кратная вх обработка в стерильной воде на микроразмельчителе тканей (5000 об/мин, 5 мин).
Водные смывы (без и с проведением центрифугирования) можно подвергнуть прямому микроскопическому анализу на содержание спор и мицелия и их непосредственному выделению приемом, аналогичным для почв. Посев растертых корней. Тщательно промытые стерильной водой от гючвы корни режут на кусочки и просушивают между двумя листами стерильной фильтровальной бумаги. Берут навески корней по 1 г и растирают их в стерильной фарфоровой ступке с кварцевым песком.
Растертую массу переносят в колбу со 100 мл стерильной воды и встряхивают в течение 5 мин. Далее готовят серию разведений и проводят посев на питательные среды. Посев Фрагментов корней. На поверхность питательных сред помещают отрезки корня, с которого удалена ризосферная почва. Если раскладывают Фрагменты размером 1 — 3 см, то часто отдельные быстрорастущие виды могут покрыть поверхность всего кусочка корня и среды в чашке Петри. Это не позволяет обнаружить другие виды микромицетов, населяющих данный фрагмент корня. Для устранения этого необходимо проводить раскладывание мелких кусочков корней (0,5 — 1 мм; толстые корни предварительно расщепляют).
Для избежания нарушений пространственного распределения грибов вдоль корня рекомендуется проводить удаление ризосферной почвы не водными смывами, а скальпелем, препаровальной иглой или кисточкой. Небольшие кусочки корня стерильной препаровальной иглой или пинцетом с заостренными концами переносят на поверхность среды в чашке Петри. 5 — 6 кусочков распределяют равноудаленно друг от друга.
В случае раздельного размещения на чашках кусочков с различных зон корня (корневого кончика, зоны растяжения, зоны корневых волосков, базальной части корня) можно изучать также локальные различия в составе микромицетов ризопланы. Раскладывают порядка 50 — 100 кусочков корня на различные питательные среды. Чашки просматривают в течение 3 — 10 сут и выделяют микромицеты в чистые культуры с помощью препаровальной иглы, при необходимости под контролем светового микроскопа.
Непосредственное выделение гиф грибов с корней. Корни, с которых предварительно удалена ризосферная почва, тщательно просматривают под бинокулярной лупой при максимальном увеличении и обнаруженные тифы переносят с помощью тонко заостренных препаровальных игл или пинцета на поверхность атаровой среды. Получение спор сухоспоровых аскомицетов и пикяидиалъиых гифомицетов. Выделение в чистые культуры сумчатых и пикнидиальных грибов, плодовые тела и пикниды которых образуются внутри или на поверхности корней, других растительных и животных тканях, экскрементах животных, может быть серьезно затруднено из-за высокой плотности популяций быстрорастущих и обильноспороносящих грибов и других организмов. Проведение стерилизации образцов часто убивает и интересующие исследователя виды грибов.
Существует метод получения спор сухоспоровых аскомицетов с активным споро- отделением, плодовые тела которых снабжены отверстием, с последующим перенесением этих спор на питательные среды. Метод не пригоден для вьщеле- 252 ния грибов, споры которых погружены в слизь или чьи плодовыс тела лишены отверстия.
Им можно получать споры некоторых пикнидиальных грибов. В стерильные чашки Коха или Петри диаметром 10 — 18 см помещают маленькие стерильные чашки Петри (3 — 5 см), предварительно сняв с них крышки. Свежие образцы с плодоношениями грибов (корни, стебли, листья) осторожно очищают от частичек почвы и растительных остатков, кладут на края маленьких чашек Петри так, чтобы они не касались их дна, или помещают на стерильную сетку (металлическую или пластиковую) с крупными отверстиями.
Образцы можно поместгпь и на стерильные стеклянные палочки в большой чашке Петри. Плодовые тела или пикниды обязательно должны располагаться отверстиями вниз. Разложенные над чашками образцы накрывают кружками (2 — 4 шт.) или полосками стерильной увлажненной фильтровальной бумаги, или в одну из чашек наливают стерильную воду для повышения влажности воздуха. Через 3 — 48 ч маленькие чашки вынимают и заменяют новыми в случае продолжающегося отделения спор. Под малым увеличением микроскопа находят места с одиночными спорами и с помощью препаровальной иглы переносят их на питательные срелы. Метод накопительной культуры во влажных камерах. Метод используют для выявления грибов, развивающихся на поверхности корней и инфицирующих их внутренние ткани.
В качестве влажных камер применяют чашки Петри, на зпо которых помещают стерильную фильтровальную бумагу. Влага в чашках держится дольше, если под бумагу подкладывают стерильную марлю или вату. Фильтровальную бумагу увлажняют стерильной водой, не создавая при этом избытка воды на поверхности. Отрезки корней (3 — 5 см) раскладывают на поверхность бумаги, и чашку Петри ставят в термостат для инкубации при температуре 18 — 24 С. Периодически, начиная со 2-х сут, корни просматривают под бинокулярным микроскопом и с помошью препаровальной иглы выделяют грибы в чистую культуру. При исследовании состава микромицетов ризопланы параллельно выявляют инфицированность грибами внутренних тканей корня.
Выделение микромицетов из внутренних тканей растений. Для установления патогенных видов микромицетов, внедряюшихся во внутренние ткани корня, стебля, листьев и семян, и эндофитных грибов проводят стерилизацию поверхности отмытых от почвы образцов растения различными антисептиками. Проводят погружение исследуемого объекта в 0,1%-й раствор сулемы с последующей многократной прамьвкой 50%-м этиловым спиртом и стерильной водой; обработку в течение 1 мин 0,1 — 1%-м раствором азотнокислого серебра; 1 — 2%-м раствором медного купороса в течение 2 — 5 мин и затем тщательной отмывкой образцов стерильной водой; 1%-м раствором в течение 1 мин или парами формалина, 0,1 — 1%-й бромной водои; 1Π— 15%-м раствором перекиси водорода; 2%-м раствором гипохлорита натрия.
Экспериментально подбирают оптимальный для конкретного объекта реагент, его концентрацию и время экспозиции (наиболее часто оно составляет от 10 с до 2 мин). После стерилизации корни промывают стерильной водой, меняя ее 3 — 4 раза для удаления стерилизующего агента. Отмывка от сильнодействующих соединений контролируется по качественным реакциям (сулемы — по качественной реакции на хлор с азотнокислым серебром). Затем корни или другие части растений разрезают стерильным скальпелем на мелкие кусочки и помещают во влажную 253 камеру.
Инкубацию ведут до появления на их поверхности мицелия и споро- образования. Вь1деление в чистую культуру проводят препаровальной игло1 под контролем светового микроскопа. Плотность заселения мицелия (численность грибов в тканях корня) опрелеляют путем посева на сусло-агар определенной навески растертых корней. Отрезки корней после стерилизации поверхности можно вместо влюхнов камеры раскладывать на разные питательные среды, При этом лучше использовать маленькие фрагменты корней (0,5 — 1 мм), чтобы снизить вероятность их инфицирования грибами, сохранившими жизнеспособность, но колонизирующими только поверхность корня.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
