А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 71
Текст из файла (страница 71)
Чашки инокулируют ! мл почвенной суспензии и инкубируют при 28 "С во влажной камере. Колонии микромицегов появляются на поверхности лигнина через 3— 4 нед. В качестве единственного источника энергии в среды добавляют также различные производные лигнина (ванилин, сирингальдегид, и-гидроксибензальдегид и др.). Эти вешества в концентрации не выше 0,01 % вводят в минеральную основу среды Чапека 10-кратноразбавленную. Повышать концентрацию производных лигнина не рекомендуется, поскольку они, как и все фенолы, токсичны для микроорганизмов. Для выделения гужусоразрушаюи1их грибов используют гумат натрия (в концентрации до 0,01%) в качестве источника углерода в минеральной основе среды Гетчинсона с )~Н„)л)Оз,' применяют также силикагелевые пластинки, пропитанные минеральным раствором Виноградского (2 — 3 мл на чашку) и гуматом натрия (8 — 10 мг на чашку в 0,02 н. растворе гидроокиси натрия).
При учете и выделении дролсогсевых грибов методом посева используется разведение 1: 5 — 1: 50 для минеральных горизонтов и 1: 100 — 1: 1000 для подстилки, поверхности растений. Наиболее широко применяется сусло-агар (6— 7' по Баллингу с молочной кислотой — 4 мл/л), глюкозопептонный агар, глюкозоминеральная среда. Для игп'ибирования роста бактерий применяют также антибиотики — стрептомицин сульфат (20 мг/л) с левомицитином (20 мг/л) и хлортетрациклином солянокислым (100 мг/л). Развитие мицелиальных грибов подавляют циклогексимидом (50 — 500 мг/л) и пропионатом натрия (0,15— 0,25 %). Эти соединения подавляют рост и отлельных групп дрожжей (циклогексимид уже в концентрации 50 мг/л — представителей рода С~ургососсив, пропиопат натрия — рода Кйос(оголи/а).
Поэтому для этих целей используются и другие ингибиторы: дифенил (0,005 — 0,01%), красители бенгальский розовый (0,003%), кристаллический фиолетовый (0„001%), бромкрезол пурпурный (0,002%). Олигонитрофильные дрожжи, относящиеся главным образом к липомицетам, учитывают на среде Эшби и других безазотистых средах. Для липомицетов рекомендована также среда 1Оргенсена и Даниелсона. Посевы разведений инкубируют при 18 — 20 С, или при 0'С для психрофилов и 5— 7 С для мезофилов, для вьщеления патогенных видов при 37 С. Учет и выделение проводят на 3 — 4-е сут инкубирования при 37'С, на 7 — 10-е сут — при комнатной температуре, 14-е сут — при 5 — 7 С и после 20 сут — при 0'С.
Рекомендуется применять низкотемпературное инкубирование, которое снимает необходимость добавки ингибиторов роста микроскопических мицелиальных грибов при температурах выше 24 — 26 'С. При низкой плотности популяций липомицетов используют посев на среду Эшби со стептомицином рассылкой почвенного мелкозема и метод почвенных комочков, приготовленных из густой водно-почвенной пасты. Из 100 мг почвы готовят около 100 комочков, раскладывают по 50 на чашку и инкубируют 3 — 4 нед при 18 — 22 'С.
Край слизистых обрастаний просматривают пол микроскопом и выделяют из него культуры липомицетов. Для вьщеления гритопатогенных грибов из почвы используют среды с анти- грибными антибиотиками (табл. 18.2). Наиболее часто применяют полиеновые антибиотики (эндомицин, нистатин, пимарицин) и циклогексимпд, обладающие широким фунгицидным действием, но вместе с тем не подавляющие рост и развитие отдельных видов фитопатогенных микромицетов.
Широко используются для этих целей и такие химические соединения, как красители (бенгальский розовый, кристалл- и генцианвиолет, малахитовьгй зеленый), спирты, хлораты, фенолы, пентахлорбензол и его производные — коммерческие фунгициды (каптан, пентахлорнитробензол, беномил, ботран и др.). При изоляции фитопатогенных грибов родов ВГро1алл, Ситт1аьа, 27гесЫега, Ехгеор6~1ит для подавления быстрорастущих сапротрофных грибов можно использовать дезоксихолат натрия (1% от состава среды), желчные кислоты (1 — 5 %), сорбит (1 %).
Для выделения фитопатогенных грибов из почв и растений предложено множество сред. Широко используют различные растительные среды: картофельный, картофельно-морковный, мучной (овсяный„кукурузный и др.) агар„среды ца основе овощного сока У-З). 237 Таблица 18.2 Химические агенты для создания селектнвных сред Грибы Антибиотики Фуигициды Другие соединении /унит, рйугорагнаса Беномил, 5 — 20 ррш; РСг!В, 25 — 100 ррш Пимарицин, 20— 100 ррш; эушомицин, 5 ррш Галовая кислота, 425 ррш Аврал!!Ы Танин 20%-й дяи А. тлея Ботран, 10 ррш, для А. /)ауия рияаг!ит Стрептомицин, 300 ррш РСг)В, 100 — 750 ррш, в 0,5%-м пептонном агарс К- мила-бисульфит, 300 рргп рв г!с!!!!ит даМае Стрептомицин, 200 рр1п„и др.
Полигалактуроновая кис- лота (0,2%-я) в почвен- ном агаре или эшнол 0,5%-й в водном агаре РС)х!В, 75 рргп, в кар- тофельно-декстрозном агаре Вал!д!отусе- Еея а-фецилфенол, 6 ррш Беномил, 1 ррш Дерматофи- Циклогексимид Волосы или перья 500 рргп; хлорамфсникол, ЗΠ— 100 ррп| Для изоляции из почвы и зараженных нематод энтоманаглогенного гриба раасу!отусея !!!ас!иих применяют среду следующего состава: картофельно-декстрозный агар (фирма «Дифкоь) — 39 г; )х)аС1 — 10 г; фунгициды пентахлорбензол и беномил — по 50 мг; вода леионизированная — ло 1 л.
Среду автоклавируют 15 мин при 121 С; охлаждают до 45 — 50 'С; добавляют 100 мг сульфата стрептомицина; 50 мг хлортетрациклина монохлоргидрата; 1 мл тергитола и разливают в чашки Петри. Для выделения хищных микролшцетов из почвы предложен водный агар (4— 5 %) без добавки питательных веществ. Добавка нематол или их личинок повышает эффективность обнаружения нематофаговых грибов. Обнаруженные грибы пересевают на арбузно-пептонный агар. Одновременно таким способом можно выявить в почве микопаразитические виды зигомицетов. Амебофаговые грибы выделяют, используя газон Ага!айаг!ег сЬгоосассит на чашке Петри, который инокулируют исследуемой почвой.
На нем развиваются амебы, инфи- 238 В качестве примера можно привести среду для выделения и учета в почве Рияапит ахуярогит — возбудителя фузариозного увядания и корневых гнилей растений, в состав которой входят (г/л): ХаУ!Оз — 2,0; К«НРО« — 1,0! КС1 — 0,5; МЯО« — 0,5; РеЯΫ— 0,01; галактоза — 20,0; агар — 20,0 и в качестве селектируюших агентов — медицинская желчь — 15 мл/л, пентахлорбснзол — ! г/л, стрептомицин сульфат — 0,3 г/л.
Производят посев 1 мл почвенной суспензии из разведения 10 ' глубинным способом. Засеянные чашки ипкубируют 7 — 10 суг на свету при 26 — 28 'С. По истечении этого времени на среде образуются характерные колонии Рияалит охуврогит с пленчато-пушистым мипелнсм телесно-розового цвета, хорошо диффсренцируюшиеся от других видов грибов.
пированные или служап!ие приманкой для амебофаговых грибов. Энтомопатогенные грибы обычно выделяют на сусло-агар, картофельно-декстрозный агар и среду Сабуро. В случае аскомицетов рода Согбусерз образцы насекомых помещают в чашку Петри и отстреленные споры переносят на агаровые среды. Другие грибы довольно успешно выделяют из тканей инфицированных беспозвоночных.
Копрофцльные грибы часто выделяют, инкубируя образцы субстратов на влажной фильтровальной бумаге в чашке Петри и периодически просматривая под стереоскопическим микроскопом. С помощью препаровальной и«лы или оттянутой стеклянной пипетки спорулируюп!ие дейтеромицеты, аскомицеты и зигомицеты переносят на питательные срелы. Споры Р(1оЬо!из и отстреливающих аскомицетов часто можно обнаружить на крышке чашки Петри и пере- сеять на питательные среды иглой. Для выделения термифильных грибов в качестве станлартной среды предложен г'рбмк-агар; применяют также сусло-агар, овсяный агар, среду Сабуро (которая широко используется для выявлении оппортунистических и патогенных микромицетов) и ряд лругих сред с повышенной (1,5 — 3 раза) концентрацией антибактериальных антибиотиков (стрептомицина) (50 — 100 мг/л), ауреомиципа (до.300 мг/л).
Для изоляции грибов, способных к риалу в анаэробных условиях, — фузириев, мукоровых, триходерм, используют модификации методики Хангсйта. Посев проводят на глюкозоминеральную агаризованную (3%-й агар) среду следующего состава (г/л): КН,РО4— 1,0; КП вЂ” 0,5; МяБО4 — 0,5; ЕеБОд — 0,01; ()ЧН4)2504 — 2,0; пелтон — 5,0; глюкоза— 5,0; дрожжевой экстракт — 0,5; 1 мл/л раствора микроэлементов (мг/л): ЭДТА — 500; ГеС!г 7НгΠ— 200; ЕпС!з 7НзΠ— 10; МяС1п 4НзΠ— 3; НзВО4 — 30; СоС!г бН2Π— 2; СцС1,.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
