А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 70
Текст из файла (страница 70)
Поверхностно-активные вещества (алкилсульфат — 0,01 — 0,05%, пирофосфат натрия — 0,1%, таины — 0,0001%) в указанных концентрациях добавляют в водные еуспензии при предпосевной обработке почв с водопрочными агрегатами, образцов выветриваемых горных пород и минералов, десорбции мипелия и спор с поверхности растений. 18.2.1. Выбор сред и условий культивирования для выделения различных групп грибов Грибы разнообразны по систематическому положению, пищевым потребностям и ростовым характеристикам, поэтому для их выделения из природных объектов не может быль одной универсальной среды.
Сапротрофные микромицеты по способности усваивать те или иные субстраты объединяют в различные пищевые группы: сахаролитические грибы; грибы, разлагающие целлюлозу, лигнин, кератин, хитин, пектин, и т.д. Не отрицая наличия существенных физиологических различий среди сапротрофных микромицетов, необходимо подчеркнуть, что деление их на специфические трофические группы в некоторой степени условно. Так, в отношении «сахарных» грибов нужно заметить, что вообще нет микроорганизмов, которые не имели бы гидролаз.
Поэтому наряду с использованием сахаров и других простых органических соединений «сахарные» грибы могут потреблять и полимеры — крахмал, ксилан, пектин. Для выделения из почв и других местообитаний определенных эколого-трофических и систематических групп грибов важнейшим этапом является выбор соответствующей питательной среды и условий культивирования посевов. Использование различных методических приемов и питательных сред позволяет вьщелить большее или меныпее число видов микроскопических грибов.
Наиболее часто из почвы на различные питательные среды вьщеляются грибы (царство Гцщусо1а) отлелов Азсошусо1а, Хуйотусо1а, формальной систематической группы несовершенных грибов Рецгеготусота, преЛСгавлякпцих чащЕ ВСЕГО анаморфы аскомипетов. Значительно реже и, как правило, только при использовании специальных сред и методов приманок изолируются представители отделов СЬу(гиЫотусога, ВазЫ(отусо1а и грибоподобные протоктисты царства Спгощ)зга отдела Оошусо(а. Подавление роста бактерий при выделении грибов из почвы и других природных источников достигают установлением кислой реакции питательной среды (рН 4,5— 5,5).
Для роста многих грибов оптимален рН около 5,5. Среды подкисляют различными 233 кислотами. В среднем на 1 л агаризованной среды добавляют 15 — 20 мл 0,1 н. рве~вора серной или соляной кислоты. Молочную кислоту обычно применяют в концентрированном виде в количестве 4 мл ва 1 л среды, лимонную — в виде 50%-го раствора в количестве 10 мл ва ! л среды. Подкисление атаровых сред до рН около 4,0 не оказывает отрицательного влияния на их способность к переходу в твердое состояние при остыванин. Концентрированные кислоты стерилизовать не надо, 0,1 и. растворы серной и соляной кислот следует предварительно простерилизовать. Наиболее часто при проведении посевов из почвы используют молочную или лимонную кислоту.
При выделении грибов в качестве ннгибиторов бактерий широко применяются различные антибиотики — стрептомицин сульфат (40 — 50 мг/л); тетрациклин, окситстрациклин, хлортетрациклин (20 — 50 мг/л); пенициллин, неомицин, полимиксин, бацитрацин (50 мг/л среды), хлорамфеникол (100 мг/л) и красители — роданистый натрий (0,25 — 0,4 моль/л), бенгальский розовый (70 мг/л).
Добавление кислот и других ингибиторов бактерий производится асептически в стерильные, охлажденные до 45 С питательные агаровые среды перед их разливом в чашки Петри. Подавляющее большинство грибов — лезо(6илы, оптимальная температура для их выделения 22 — 26 С. Для изоляции гругшировки грибов, способных к росту при пониженных гвегянературах, инкубацию посевов проводят при 4— 8 С, для терьчо4ильных — 42 — 55 С, чаще всего 45 С, и термотолерантных грибов — 35 — 42 'С. Чашки Петри с посевом помещают в эксикаторы или пластиковые пакеты для предотвращения высыхания среды.
Многие микроорганимы, в том числе грибы, меняют рН среды в зоне роста на оптимальный для своего развития. Поэтому для выделения алкалотолеран>нных и ацидог/зизьных грибов в среды вводят соединения, обеспечивающие бу(6ерность среды. Используют двузамешенный фосфат натрия и однозамещенный фосфат калия, которые в различных пропорциях позволяют создать и поддерживать рН среды в широком диапазоне (от кислой до щелочной области). При изоляции алкалотолерантных грибов в среды рекомендуется добавлять соли ХазСОз, )х(аНСОз, К,СОм (ЧазРОд в концентрациях от 0„5 до 2%, которые поддерживают рН в интервале 8,5 — 11.
Инкубацня посевов при дневном свете резко снижает спорообразование у некоторых видов грибов (Снае(отгит и ОрЫзГота), а в большинстве случаев свет не вреден или оказывает благоприятное воздействие (за исключение прямого солнечного света). Обычный дневной свет и близкий к ультрафиолетовому (в черной области — 310 — 360 нм) усиливают образование плодовых тел у аскомицетов, пикнид, целомицетов и конидий у гифомицетов (особенно темноокрашенных).
Для вьщеления быстрорасгпуи(их н эффективно усваивающих легкодоступные углеводы грибов используют сусло-агар 3 — 4' по Баллингу (как правило, сусло разбавляют водой в соотношении 1: 3), картофельно-глюкозный агар и синтетические среды с простыми углеводами — среды Чапека, Чапека с дрожжевым экстрактом, Мартина, Ролэна, пептоно-глюкозный агар Ваксмана, почвенный агар с добавкой углеводов. Для обнаружения медленнораси!ущих и слабоконкурентных видов в среды рекомендуется добавлять вещества, ограничивающие рост быстрорастущих форм микромипетов, такие„как бенгальский розовый (30 мг/л)„пропионат натрия (0,1%), дихлоран (2,6-дихлор-4-нитроанилин) для подавления мукоровых, фундазол (беномил) — пенициллов, и ряд других веществ — циклоспорин, детергенты.
234 Олигопуофные грибы и те, которые не выдерживают конкуренции за моно- сахара при высоких их концентрациях в среде и способны к росту при их следовом количестве, выделяют на «голодные» среды — водный агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с разведенным в 8 — 10 раз суслом. На этих средах большинство микромицетов развивается медленно, образуют мелкие (2 — 3 мм в диаметре) колонии, прн оптимальном разведении удаленные друг от друга, что удобно для выделения грибов в чистые культуры.
Для приготовления почвенного экстракта 1 кг почвы автоклавируется в 1 л воды, полученная суспензия фильтруется и доводится до 1 л. Если фильтрат мугный, добавляют немного Са80«и фильтруют снова. Для приготовления среды в почвенный экстракт добавляют агар (1,5%), а также используют варианты почвенного агара с добавкой других питательных элементов, КНзРО, (0„02 %) или глюкозы (0,1%). Для выделения грибов', разлагающих целлюлозу, гел«ицеллюлозу, пектин, хитин и другие соединения, их вводят в состав питательных сред в качестве источника углерода, минеральная основа которых аналогична среде Гетчинсона (возможна замена ХаХОз на ХН«)Ч Оз). Если микромицет продуцирует фермент, расщепляющий данный субстрат, то проявление этой Ферментативной активности можно обнаружить в виде зоны просветления в среде.
В случае синтеза ферментов, связанных с клеткой, необходимо удалить колонию с пластинки агара, чтобы обнаружить пятно на месте гидролиза субстрата. Нерастворимые субстраты (хитин, целлюлоза и др.) вносят в среду в виде тонко размолотого порошка. После инкубации посева вокруг колоний грибов, продуцирующих Фермент, появляются зоны просветления. Для выявления зон просветления растворимых субстратов их осаждают или окрашивают. Необходимо учиаывать, что краситель часто убивает микроорганизмы, поэтому, если требуется выделить культуру, предварительно делают реплику колоний. Существует альтернативный способ, заключающийся в присоединении красителя к субстрату.
Для этого обычно используют ремазол бриллиантовый синий или азур. Эти приемы широко используют при первичном скрининге продуцентов различных Ферментов (табл. 18.1). Целлюлозоразрущающие грибы изолируют на питательные среды Гетчинсона, Частухнна, которые содержат в качестве источника углерола целлюлозу или карбоксимегилцеллюлозу (в концентрациях 0,8 — 1,0%). Стерильную фильгровальную бумагу раскладывают на поверхность питательной среды или вносят в нее в измельченном виде (растертой в ступке или шаровой мельнице в порошок). Фильтровальную бумагу следует предварительно прокипятить в дистиллированной воде и проверить отсутствие в ней примеси крахмала по отрицательной йодной реакции. Для приготовления среды необходимо брать очищенный агар.
К минеральной основе среды можно также добавлять микрокристаллическую целлюлозу или аморфную целлюлозу (обработанную предварительно фосфорной кислотой и промьпую дистиллированной водой). Проводят посев разведений или почвенных комочков (по 50 комочков на чашку). Эти среды часто используют для вьщеления сумчатых грибов (рода СЬаегот1ио1 и др.). Для выделения грибов„разлагаюи)их лигнин, в среды вносят в ! %-й концентрации препарат лигнина или субстраты, содержащие его в большом количестве. Разрушающие лигнин микромицеты можно выделить, используя силика- Таблица 18.1 Среды и реагенты для выявления внеклеточных н связанных с клетками ферментов микроорганизмов Критерий лля отбора штаммов Фсрменг Субстрат Реагент Крахмал/гликоген Раствор йода Амилаза Прозрачные (и-амилаза) или красные ф-амилаза) зоны на окрашенном фоне Крахмальный азур Бледно-синий ореол а-Амилаза Целлюлоза Цсллюлозный азур Фильтровальная бумага Аморфная или микро- кристалическая цел- люлоза Бледно-синий ореол Разложение фильтровальной бумаги Зоны просветления Хитиназа Хитин Прозрачные зоны а нерастворимом хитине Пектатлиаза Яблочный пектин или полигалак|уроновая кислота Гексадецилмс- тиламмоний бромид Прозрачные зоны в осажденном субстрате Ксиланаза Этанол Ксилан Прозрачная зона в осажден- ном субстрате через 16 ч Пуллуланаза Зтанол или ацетон Прозрачная зона в субстрате чсрез 16 ч Пулл улан Протеазы Снятое молоко Желатин Зоны просветления Зоны просветления в осаж- денном субстрате Насыщенный раствор сульфата аммония Измельченная кожа с азуром Бледно-синие зоны пщролиза Твин-60, 80 Липаза, зстераза Триолеин Твин вводят вподходяшую среду; опалеспируюший ореол Зоны просветления Оливковое масло 236 гельные пластинки, пропитанные минеральными солями, на поверхность которых нанесен порошкообразный лигнин в количестве 0,25 г на чашку.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
