А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 68
Текст из файла (страница 68)
Метолы очистки подвижных нитчатых цианобактерий, как и в случае получения альгологически чистых культур, основаны на том, что нити, расползаясь по агаризованной среде, с одной стороны, механически очищаются от сопутствующих бактерий, а с другой стороны, как бы «обгоняют» их, отползая на значительное расстояние. В чашку Петри с агаризованной средой, иногда наполовину затемненную черной бумагой, помещают небольшой комочек нитей цианобактерий, инкубнруют на свету, а через несколько часов находят под микроскопом наиболее далеко отползшие и наименее загрязненные бактериями нити и отсевают их в пробирки с жидкой средой. Однако, как правило, нитчатые микроорганизмы особенно трудно подла!отея очистке.
Помимо методов, связанных с механическим отделением клеток или колоний, предложено большое количество методов очистки культур цианобактерий и водорослей, основанных на обработке их химическими соединениями: зтанолом, риванолом, фенолом, различными детергеггтами, йодом (для диатомовых водорослей), агттисептиками, а также различными антибиотиками и их сочетаниями. Например, для очистки СНогеПа была предложена обработка левомицетином (1 мг/мл) и стрептомицином (1000 ел./мл) в течение з! ч с последующим отмыванием от антибиотика и посевом на свежую среду.
При очистке Липа)геПа положительные результаты отмечены при обработке в течение суток пенициллином (15 000 ед./мл) и стрегггомицином (12 500 ед./мл), для очистки разных водорослей предложено использовать также актиномицин, колимицин, хлортетрациклин, окситетрациклин, эритромицин*. Возможность применения антибиотиков обусловлена тем, что их альгнцидные концентра- * См., например: Методы физиолого-биогиилгичсского исследования водорослей в гилробиологической практике. — Киев: Наукова думка, !975.
ции, как правило, выше бактерицидных (например, левомицетин подавляет рост бактерий в концентрации 50 мг/мл, а хлореллы — в коьщентрации 200 мг/мл). Во многих случаях, однако, разница между этими концентрациями очень мала и обработка антибиотиком оказывается неэффективной. Из физических методов наиболее эффективным способом очистки водорослей и особенно цианобактерий считается обработка ультрафиолетом, поскольку цианобактерии более устойчивы к облучению, чем сопутствующие микроорганизмы. Однако эти микроорганизмы часто оказываются защищены слизью и чехлами цианобактерий, поэтому очистить культуру удается не всегда.
Кроме того, при УФ-облучении существует вероятность получить мутантные формы выделяемых организмов. Выделенные чистые культуры цианобактерий и водорослей периодически пересевают а жидкую, полужидкую или на твердую агаризованную среду и выращивают при постоянном или периодическом освещении.
В некоторых коллекциях их поддерживают в условиях пониженной температуры (15 С) и освещенности. На твердой среде водоросли обычно можно длительно хранить в холодильнике, цианобактерии хранить а холодильнике не рекомендуется. 17.2. ВЫДЕПЕНИЕ АНОКСИГЕННЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ Основными элективными условиями, которые надо создать при выделении культур большинства аноксигенных фототрофных бактерий, являются: наличие света, присутствие в среде подходящего донора и акцептора электронов, а также отсутствие Оз. Изменяя эти и другие параметры (спектральный состав света и его интенсивность, окислительно-восстановительный потенциал и концентрацию сульфида, наличие и состав органических соединений, температуру и значение рН среды), можно добиться преимущественного роста представителей определенных групп. Отбор проб Большинство аноксигенных фототрофных бактерий обитают в анаэробной зоне различных водоемов: в илах и придонной воде озер, в морских прибрежных волах, серных и горячих источниках, сточных водах, некоторые виды встречаются в почве.
Нередко пурпурные серобактерии образуют на поверхности ила и разлагающихся водорослей заметные невооруженным глазом розоватые пятна или окрашивают слои воды в пурпурный и розовый цвет. Пробы воды и ила отбирают в стерильные флаконы (заполняя их не доверху) и закрывают пробками. Анализ проб и посев микроорганизмов рекомендуется проводить как можно скорее, в случае длительного хранения пробы можно держать в холодильнике. Приготовление сред и получение накопительных культур Исторически первые накопительные культуры аноксигеииых фототрофов были получены в !883 г.
С.Н.Виноградским при постановке так называемой колонки Вино- 228 градского (см. гл. 37). В результате противоположно направленных процессов диффузии Оз и Нз8 в колонке образуются градиенты их концентраций, а также градиент окислительно-восстановительного потенциала. При этом создаются зоны, условия в которых соответствуют экологическим нишам разных групп бактерий. гйототрофные бактерии развиваются на разной высоте, образуя окрашенные слои воды или окрашенные гцггна на границе между илом и стеклом цилиндра на стороне, обращенной к свету. Как модель, демонстрирующая развитие микробиологических процессов в природной системс„колонка Виноградского сохраняет значение до наших дней, однако лля выделения фототрофных бактерий чаще используют синтетические среды, позволяющие выращивать микроорганизмы в контролируемых условиях.
Синтетические среды для фототрофных бактерий были впервые разработаны М. Бейеринком и немного позднее К. Б. ван Нилем. В настоящее время известно большое число рецептур сред, предломсенных разными исследователями*. Примеры типичных по составу сред приведены в приложении 4. Пурпурные и зеленые серные бактерии обладают сходными пищевыми потребностями.
Одной из наиболее универсальных для них является минеральная среда, предложенная Г.Библом и Н. Пфеннигом**. Основные компоненты (г/л): КН,РО4 — 1,0; х(Н4С! — 0,5; М8804 — 0,4; СаС1, — 0,05; микроэлементы, а также 14аз8 (360 мг/л для пурпурных и 600 мг/л для зеленых бактерий) и ХаНСО, (1,5 г/л), которые готовят отдельно в виде 10%-х растворов и вносят в среду после стерилизации.
В зависимости от гого, откуда выделяют бактерии, в среду вносят ! — 20 г/л !чаС1 и до 3 г/л МВЯО«. Морские штаммы бактерий также часто нуждаются в витамине Вкй его вносят в количестве 0,002 мг/л. Зеленые серобактерии по сравнению с пурпурными часто предпочитак1т несколько более низкие значения рН среды н более устойчивы к пулы)>иду, что можно использовать для получения их преимущественного роста.
Кроме того, зеленые серобактерии более эффективно используют свет и могут расти прн более низкой освещенности. Одним из элективных условий для роси пурпурных бактерий может быть освещение злинноволновым светом (800 нм или более), что достишется с помощью соответствующих светофильтров. Преимущественного развития отдельных представителей пурпурных серобактерий можно также достичь, варьируя интенсивность и режим освещения или температуру. Так, осве!пенносг! 2000 — 3000 лк и температура 30'С более способствует доминированию быстрорастущих видов (например, АГ)осйоп!аг(ит ипозит, прежнее название Спголгагги«п а!погпт), а более пнзкяе освещенность (50 — 300 лк) и температура (20 С), а также чередование периодов света и темноты более благоприятны для медпеннорастущнх (Секста!(пп! ойепй или /зосЬгоп!ау!пуп угагт!н81, прежнее название С!!гоп!аг(ип! ваггптхй). Примером среды для несерных фототрофных бактерий может служить среда Ормерода, содержлщая (г/л): М88О4 7НзΠ— 0,20; СаС!з 2НзΠ— 0,08; РсЯО«7НзΠ— 0,01; КгНРО4 — 0,90; КНгРО« — 0,60; ()9Н4)!804 — 1,25; ЭДТА — 0,02; микроэлементы — 1 мл; палат )4а — 2,0; дрожжевой экстракт — 0,10.
Состав микроэлементов (г/л): Н,ВО,— 2,80; Мп804 4Нз0 — 2,10: ЫазМо04 2НГΠ— 0,75; Еп8О«7НзΠ— 0,24; Сн(ЫОз)е ЗНеО— 0,04. Пурпурные несерные бактерии предпочитают фотоорганогстеротрофные условия роста и часто чувствительны к сульфиду. В среды для их выделения вносят органический субстрат (обычно ацетат, малат, пируват или другие )х(а-соли органических кислот) в качестве донора электронов и основного или дополнительного источника углерода. Обязательным компонентом среды для большинства несерных бактерий является раствор витаминов или дрожжевой экстракт. Иногда в среду вносят тиосульфат На (0,2 г/л). Сульфид в большинстве случаев не вносят и даже часто снижают концентра- » Подробные сводки имеются, например, в руководствах «!'!»е Ргокагуогев» н «Вешеу'я Манна! оГ Вув!еп1впс Ввсипо!ояу» *' В!еЫ Н., РГепп!8 14.
1978. Е!пт. по: Т!уе Ргокагуо!ев. ! 992. — Ч.! Ч. — Р. 3204. 229 цию сульфата в среде, чтобы избежать развития в накопительной культуре сульфатредукторов, однако известны пурпурные несерные бактерии, особенно морские штаммы, которые устойчивы к сульфиду и способны хорошо его использовать как донор электронов. Элективные условия для развития представителей отдельных родов и видов можно создать внесением в срелу различных субстратов (например, бензоатв или формиата для К!юг(орзеяг(отюпдз ра!их!газ) и/или вариацией рН среды (например, при рН 5,2 и наличии в качестве субстрата сукцината !ча созлаются условия для преимущественного выделения ятгог!орхелг(олюпах ас!г(орЫ!а и Клог(от!сгобгигл ияллге!и).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
