А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Этот слабокислый исходный раствор можно хранить до года при 5 С в темноте. Рабочий раствор, используемый для тестов, сохраняет стабильность в течение лишь нескольких дней. Готовят его, разводя исходный раствор в 100 раз в 1 мМ уксусной кислоте. Окисление Мп можно контролировать количественно по исчезновению Мп ' из раствора колориметрически с формальдоксимом или атомно-абсорбционной спектроскопией. Количество оксидов Мп можно определить, отфильтрован их от культуральной жидкости на мембранных фильтрах, растворив (восстановив) их до Мп ' и измерив количество получившегося Мп~'.
Растворение м можно провести несколькими методами: 1) обработкой сильной кислотой (6 М НС1) в течение нескольких дней; 2) обработкой смесью 5 частей концсгггрированной Н!л!Оз с тремя частями концентрированной НС! в тефлоновой посуде в течение 3 ч при 105'С; 3) выщелачиванием в течение нескольких часов концентрированной азотной кислотой, содержащей 1% ()л!НзОН)С! (гидро- 212 ксиламин-НС1); 4) вьтщелачиванием концентрированной азотной кислотой, содержащей 3 % (вес/объем) Н,Оъ Выбранный метод зависит от природы анализируемого осадка и проведения последующих анализов. Как правило, хороший эФФект достигается при действии ! % (вес/объем) ХН,ОН без НС1, поскольку это быстрый и легкий метод обработки осадков, не дающий побочных эФФектов при атомной адсорбции.
Мп-окисляющие бактерии могут быть идентиФицированы и микроскопически, однако при таком подходе следует учесть некоторые потенциальные трудности. Почкующиеся или образующие выросты Мп-окислители легко обнаружить внутри и около оксидов Мп, в других случаях оксиды Мп должны быть удалены, прежде чем клетки будут идентифицированы. Обработка ЛБГ приводит к удалению осадков Мп. Она рекомендуется при работе со световым микроскопом с пробами, взятыми из природных экосистем, в которых идентиФицируют Мп-окислителей. Осадки оксидов могут быль разрезаны и просмотрены в поле просвечивающего электронного микроскопа на предмет установления степени и Формы контакта клеток с оксидами.
При этом во многих случаях исследователь может столкнуться с тем, что оксиды Мп не имеют ничего общего с клетками, поэтому результаты микроскопических исследований следует интерпретироватЬ с особой осторожностью. 15.3.4. Применение Мп-окислителей Высокий уровень Мп в водопроводной или колодезной воде может быть опасен для человека и животных. Повьппение концентрации Мп может произойти в летние месяцы, когда уровень кислорода в воде снижается вследствие усиления дыхания водных организмов, что создает благоприятные условия для апаэробного восстановления оксидов Мп. Как только Мп восстанавливается до Мп ', он становится чрезвычайно устойчив в присутствии кислорода, и одна пз потенциальных возможностей применения Мп-окислителей — использование для снижения концентрации Мп~ в питьевой воде.
Оксиды Мп также являются великолепными акцепторами электронов в анаэробном Мп-дыхании. Поэтому возможно применение Мп-окислителей для стимулирования минерализации органических остатков в осадках. 15.3.5. Значение окисления Мп~" для Мп-окислителей Имеется лишь одно сообщение о том, что морской штамм РзеиЛотопахзр. 3-36 мог расти в хемостате непрерывно с лимитом по Мп, окисляя Мпы и Фиксируя СОъ В клетках обнаружен ген, кодирующий синтез болыцой субъединицы ГснВ)зСО, и карбоксисомы, в которых, как полагают, содержится больгиая часть этого Фермента. Данный орпшизм поэтому является отличным кандидатом на изучение хемолитотроФного роста для Мп-окислителей. Есть сведения, что постоянный приток добавляемого Мп2' существенно удлиняет стационарную Фазу роста культур 2.ергойг)х, что может играть значительную роль для клеток в природных местообитаниях.
Возможно также, что окисление Мп" проводят многие группы микроорганизмов в неспециФических реакциях просто для того, чтобы снять высокий, потенциально токсич- 213 ный уровень этого катиона в микроокружении. Ясно, однако, что работа по выделению настоящих, облигатных Мп-окислителей, использующих эту реакцию для получения метаболической энергии, еще впереди, но совершенно очевидно, что данный раздел книги поможет исследователям, начинающим изучение интересной и важной в геохимическом плане группы микроорганизмов. Глава 16 пОПУчени~ нАкОпит~льных и чистых культу АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 16.1.
НАКОПИТЕЛЬНЫЕ КУЛЬТУРЫ ПЕРВИЧНЫХ БРОДИЛЬЩИКОВ Получение накопительных культур микроорганизмов, обладающих сложными пищевыми потребностями, рассмотрим на примере организмов, осуществляющих брожение (дрожжи, молочнокислые, пропионовые, маслянокислыс бактерии). Первое условие для выделения таких организмов — химическая природа органического субстрата. Чтобы субстрат мог сбраживаться, он не должен быть ни слишком окислен, ни слишком восстановлен. Лучшим субстратом для брожения служат сахара, но сбраживаться могут также органические кислоты, аминокислоты и другис соединения такой же степени окисленности.
Второе необходимое требование — анаэробныс условия выращивания организмов, не только потому, что многие из бродилыциков являются строгими анаэробами, но и для предотвращения конкуренции со стороны аэробных форм. При выделении микроорганизмов-бродильщиков используют неодинаковую чувствительность клеток смешанной популяции к продуктам обмена веществ, накапливающимся в среде, в первую очередь к кислотам и спиртам. В ряде случаев в качестве условий элективности снижают рН среды и/или добавляют этанол.
Молочнокислые бактерии можно накопить, используя солодовое сусло без мела, т.е. среду, первоначально не обладающую элективпостью. После внесения природного материала, содержащего молочнокислые бактерии, в среде наряду с молочнокислыми бактериями хорошо развиваются представители родов Епгегобас!ег и Взсбепсйи. Однако по мере накопления в среде молочной кислоты и этилового спирта, образуемого гетерофсрментативными видами, условия лля развития энтеробактерий постепенно ухудшаются, тогда как молочнокислые бактерии, которым свойственна высокая кислото- и спиртоустойчивость„продолжают расти. Таким образом, в результате развития молочнокислых бактерий среда приобретает необходимую степень элективности, что и обеспечивает получение накопительной культуры этих бактерий.
Молочнокислые бактерии можно выделять и на среде другого состава (Уи): растительный (морковный, капустный) отвар — 10; дрожжевой автолизат— 1,0; пептон — 1„0; глюкоза — 2,0; этиловый спирт — 8 — !6. Спирт следует вносить в инокулированную субстратом жидкую среду через 18 — 24 ч культивирования. Из жидкой среды производят высев на агаризованную среду того 214 же состава, но без спирта, в которую добавляют 4 % измельченного мела. Молочнокислые бактерии при росте на данной среде образуют вокруг колоний зоны просветления, обусловленнопз превращением нерастворимого углекислого кальция в растворимый лактат кальция. Среда обитания молочнокислых бактерий — филлосфера (листья, стебли, цветы и плоды растений), почва — ризосфера и верхние горизонты, где содержится много растительных остатков, желудочно-кишечный тракт животных и человека.
Все перечисленные места обитания могут быль использованы для выделения молочнокислых бактерий. Но, конечно, лучшим источником выделения является молоко и молочные продукты. Хранят молочнокислые бактеэии на средах того или иного состава с добавлением 8 — 12 % этанола (см. гл. 11). По практической значимости с молочнокислыми бактериями конкурируют только дрожжи (см. гл.
22). Как и молочнокислые бактерии, они широко распространены на поверхности листьев, цветков и плодов. Дрожжи — неизменные обитатели молока и молочных продуктов. Они появляются в молоке уже через несколько часов после дойки и составляют более 10% от общего числа микроорганизмов. Дрожжи в молоке представлены видами Р(сп(а, Ююдогоги1а, небольшим количеством сахаромицетов. Дрожжи встречаются в лесной подстилке и почве, но их численность в почве ооычно низко, чем бактерий, актиномицетов и мицелиальных грибов. Дрожжи легко обнаруживаются в почвах с высоким содержанием свежих растительных остатков, умеренно водно-температурным режимом и низким значением рН. Чаще других в почвах встречаются представители родов Еуротусез, Тоги1оряи, Сгургосеесиз и СапйЫа.
Накопительную культуру дрожжей получают путем высева исследуемого материала на сусло-агар, подкисленный молочной кислотой до рН 4,0 — 4,5 ~ что исключает рост большинства бактерий), и культивирования при температуре 6 'С в течение двух недель. Для накопления пропионовокислих бактерий, которые растут довольно медленно, не выносят кислых условий и не могут конкурировать при росте на богатых средах с такими организмами„как молочнокислые или энтеробактерии, в качестве факгора элективности используют молочную кислоту.
В отличие от других бродилыциков, пропионовокнслые способны сбраживать этот субстрат. Для получения накопительной культуры этих бактерий используют нейтральную среду, содержащую 20 г лактата натрия и 1О г дрожжевого экстракта на 1 л воды, засевают природным материалом, содержащим пропионозые бактерии. Для инокуляции среды лучше всего использовать твердые сорта сыров. Инкубируют засеянные среды при 30 'С в анаэробных условиях в течение двух недель.
Для получения колоний пропионовокислых бактерий накопительную культуру высевают на молочно-сывороточный агар в чашки Петри. Зля того чтобы отличить колонии пропионовых бактерий от колоний молочнокислых, которые также могут появиться на этой среде, выделенные штампы проверяют на образование кислот в молочно-кальциевом бульоне, выращивая их в течение 30 сут. Кроме сыров и молочных продуктов пропионовокислые бактерии можно выделить также с поверхности кожных покровов человека и из желудка жвачных. При выделении последних необходимо помнить, что оптимальная темпеэатура для их роста 37 С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
