А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Растворимый Мпы может затем диффундировать в окисленную зону, где подвергается окислению Мп-окислителей. Такие процессы заноса Мпм в окисленные зоны постоянно встречаются в гидротермальных источниках, а также в мсс гах выхода горячих подземных источников.
В стратифицированных водных местообитаниях микробное окисление марганца может быть процессом значительной биогеохимической важности. Свежсобразованные оксиды Мп возвращаются в виде твердого преципитата в осадки или в анаэробную водную зону, где они могут послужить акцепторами электронов в анаэробном окислении Ге", Н>В и органического вещества.
Мп хорошо подходит для этой роли, так как не образует нерастворимых сульфидов, и поэтому остается в растворе в анаэробных зонах. В таких местах наблк>дается развитие бактерий, заключенных в чехлы (подобно Еерго>лг>х), пропитанные оксидами Гс или Мп. Выделение Мп-окислителей. В местах с высоким содержанием оксидов Мп обычно наблюдают массовое развитие клеток, напоминающих виды Нурлшл(ггоЬ(ия>, что делает вероятным участие этих бактерий в формировании таких осадков. В других случаях, хотя Мп-окисляющие бактерии можно легко выделить, они не составляют большинства в местообитании и не могут быть ответственны за образование наблк>даемых осаждений оксидов.
Таким образом, можно заключить, что многие организмы, выделяемые как Мп-окисляющие в культуре, никогда не принимают участия в формировании осадков оксидов марганца в природе. Лабораторные накопительные культуры с различными пробами морских осадков, в которые добавлен МпС1„обычно приводят к появлению зон темного осадка оксидов Мп после 3 — 12 мес инкубации. Вокруг зон таких осадков обычно концентрируются х>ор>)юлогически одинаковые и таксономически схожие бактерии. Мп-окисянтели могут быль легко выделены в чистые культуры и хорошо растут на твердых и жидких средах, если предприняты необходимые меры к снятию токсичного действия Мп ".
Для выделения используют обычные источники углерода (ацетат, сукцинат, глицерол и т.д.). Во многих культурах окисление Мп ' начинается после того, как культуры войдут в стационарную фазу роста. Некоторые источники углерода могут снижать рН среды, другие подавляют окисление Мп. В большинстве сред используют низкие концентрации углерода, а в других в качестве источника углерола применяют аминокислоты. Поскольку окисление Мп строго зависит от рН среды и с наибольшей термодинамической эффективностью происходит при рН 7 — 8, в среды обычно добавляют 10 — 100 мМ НЕРЕЗ- буфера и контролируют рН в этом интервале.
Как правило, Мп-окислители — прототрофы, но некоторые исследователи добавляют в среды смесь вигаминов или дрожжевой экстракт. Форма добавки источника Мп ' может быть разная (ацетатные, карбонатные, хлоридные или сульфатные соли), однако добавлять эти соли в виде растворов необходимо после автоклавирования среды в виде профильтрованного раствора во избежание выпадения осадка оксидов Мп прн автоклавиуовании и связанного с этим процесса дальнейшего химического самоокисления Мп '.
Концентрации Мп в природе редко правь>шакп. 1 — 5 мкМ, а выше 10 мкМ становятся токсичными для бактерий. В некоторых средах Мп добавляктг в существенно больших конце>прациях (в миллимолярном диапазоне), что, однако, не ведет к токсичному эффекту. Для вновь выделенных лшкроорганизмов обычно рекомендук>т использовать!Π— 100-микромолярные концентрации Мп '. г. Один из способов снятия токсичности Ып включает использование непрерывных культур в хемостатах. Начинают эксперимент с культивирования на гетеротрофной среде с источниками углерода — ацетатом нли сукцинатом — и низкими концентра- 210 лиями Мп ' (5 — 20 мкМ).
Концентрацию Мп ' измеряют в куяьтуральной среде, выхо"яшей из хемостата. Когда она станет ниже 1 мкМ, концентрацию Мпм в питающем резервуаре медленно поднимают до 1 мМ или выше. Это позволяет гизучать взаимоотноззения между потреблением источника углерода и Мп' при их различных концентрациях. Непрерывные культуры позволяют также изучить высокообогашенные накопительные культуры Мп -окислителеи, выделенных из природных местообитаний, и полуж чпть культуры, использую|цие окисление Мп с целью запасания метаболической знеры .пи. 15.3.2. Среды для культивирования Мп-окислителей Среда Круибайиа.
Это богатая среда, на которой растут многие гетеротрофные окислители Мпз'. В качестве раствора может быть использована морская, пресная или дистиллированная вода. Сасгпае (г/л): РеЯО«7Н,Π— 0,001 г (можно го исключить); МпЯО«4Н,О (или МпС1,) — 0,2 г; пептон — 2,0 г; дрожжевой экстракт — 0,5 г; НЕРЕЯ-буфер — 10 мМ; рН 7,0; стерилизация — при 1 ати. Минимальная среда с сукцииатом. Это основная среда для изучения связывания и метаболизма Мп. Готовят ее на дистиллированной или искусственной моРской воде. Состав: !х!Н„С! (или К!х)Оз) — 9,0 мМ; К,НР΄— 0,4 мМ; НаНСОз— 2,0 мМ; РеЯО« — 5,0 мкМ; НЕРЕЯ-буфер — 10 мМ; раствор витаминов — 10 мл; .ха-сукцинат — 1О мМ; МпС1т — 1О мкМ. Готовят 1 л раствора витаминов на дистиллированной воде двойной перегонки при перемешивании, стерилизуют фильтрованиеги и хранят при 5 'С в темноте.
Сосшав (мг): биотин — 2,0; пианин — 5„0; тиамин-НС1 — 5,0; и-аминобензойная кислота — 5,0; пантотенат Са — 5,0; пиридоксин-НС! — 5,0; Вп — 0,1; рибофлавин — 5,0; фолиевая кислота — 2,0. Среда РС. Эту низкоконцентрированную среду используют для выделения Мп"-окисляющих видов НурЬоЫсгоЫит. Ее готовят на дистиллированной воде пли на воде источника, который изучают. Состав (г/л): МпЯО„. 4Н,Π— 0,02; дрожжевой экстракт — 0,05.
Среда РУСУ. Это еще одна среда с низкими конпентрацгими питательных веществ для выделения медленнорастущих почкующихся и чехольчатых бактерий (Рог)оппсгоЫшп и /ергогйгьх). Обычно видимые колонии развиваются на этой среде в течение нескольких дней, причем быстрорастущие гетеротрофы могут «перерасти» Мп-окислителей. Среду готовят на дистиллированной или морской воде. Состав (г/л): пептон — 0,25; дрожжевой экстракт — 0,25; глюкоза — 0,25; эаствор витаминов — 1О мл (см. вьппе); раствор минеральных солей — 20 мл. Раствор минеральных солей: 10 мг нитрилоацетата растворяют при нейтрализации КОН в 900 мл дистиллированной воды.
Затем добавляют следующие соли: СаС!з 2Н,Π— 3,34 г; РеЯО4 7Н,Π— 99 мг; МяЯО«7НтΠ— 29,7 г; чаМоО„. 2НзΠ— 12,67 г и 50 мл раствора металлов «44». Объем доводят до 1 л дистиллированной водой, и раствор„который должен быть прозрачным, хранят при 5 С. Раствор солей «44». В 1 л дважды перегнанной дистиллированной воды, к которой прибавляют несколько капель концентрированной Н,ЯО„добавляют последовательно (мг): ЭДТА — 250; ХпЯО4.
7НзΠ— 1,095; МпЯО4 4НтΠ— 154; СоС!з 6НзΠ— 20,3; РеЯО«7НзΠ— 500; СцЯО«'5НтΠ— 39,2; ХаВ«О~ 1ОНзО— !7,7. 211 15.3.3. Идентификация Мп-окислителей Выявление Мп-окислителей обычно проводят по обнаружению черных или коричневых осадков твердых оксидов Мп, которые откладываются вне или внутри клеток. Однако это свойство не является определяющим: многие бактерии образуют темные пигменты; известны также несколько кристаллических форм оксидов Мп, которые имеют разный цвет и консистенцию.
К тому же вместе с Мп-оксидами часто откладываются и другие металлы, особенно железо, привнося свой цвет и консистенцию к осадкам Мп. Для преодоления этих трудностей применяют два специфических теста на Мн. Первый тест основан на использовании бензидина-НС1, который дает голубую окраску в присутствии оксидов Мп. Реактив готовят, растворяя 5 г бензидина-НС! в 35 лш ледяной уксусной кислоты. Раствор доводят до 500 мл дистиллированной водой и хранят при 5 С.
Колонии можно напрямую проверить на наличие вокруг них оксидов Мп, заливая чашку 10 мл реактива. Колонии с осадком окрашиваются в темно-синий цвет. При работе с этим реактивом, однако, следует учитывать следующие особенности: 1) реакции мешают оксиды железа, которые дают слабое голубое окрашивание; 2) реагент токсичен и канцерогенен; 3) реагент проявляет бактерицидные свойства, поэтому колонии перед его применением должны быть реплицированы на новые чашки. Поскольку реактива токсичен, рекомендуется не использовать его, если есть альтернатива. Во втором гнесте используют реактив лейкобербелин голубой (ЛБГ)„окислительно-восстановительный индикатор, который, реагируя с Мп ' или Мп ', окисляется и из бесцветного становится голубым.
Оксиды Мп восстанавливаются в этой реакции, так что ее можно использовать для мягкого удаления оксидов из окружения клеток. Реакция с ЛБГ меньше подвержена влиянию оксидов железа по сравнению с бензидиновой и, поскольку она менее бактерицидна, может быть применена непосредственно на клетки в колониях без существенного подавления их физиологических функций. Приеотовление реагента. Растворяют 4 г лейкобербелина голубого-1 (Х,Х'- диметил-амино-п,н'-трифенилметан-о'-сульфоновая кислота) в 80 мл кипящей дистиллированной воды. Перед кипячением в воду добавляют несколько капель концентрированной фосфорной кислоты. Затем добавляют 0,3 мл концегггрированного )л!Н„ОН и доводят раствор до 100 мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
