А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 61
Текст из файла (страница 61)
Хотя А1саИХепег еиггорлиз и Раеидоьтолаз рзеийфаиа могут расти гегеротрофно с нгп'- ратом в качестве акцептора электронов, их рост в этих условиях очень незначительный. Автотрофно в анаэробных условиях с нитратом, нитритом или 1Ч,О в качестве акцепторов электронов и водородом в качестве донора из выделенных до настоящего времени водородных бактерий может развиваться только Рагасосска сГел1ггфсалк Поэтому все накопительные культуры, поставленные в таких условиях, приводят к выделению лищь щтаммов Ригасоссик 15.1.3.
Составление газовых смесей Внимание! Работа с водородом должна проводиться в хорошо проветриваемом помещении при соблюдении норм безопасности. Следует учитывать, что при 20 'С и нормальном давлении нижняя и верхняя точки воспламенения Нт в воздухе — 4% и 74,5 %; соответствующие пределы в кислороде — 4 % и 94 % Нп Это значит, что смесь 95 % Нт и 5 % От безопасна. Смесь 65% Нз+ 25% Оз+ 10%СО, — чрезвычайно взрывоопасна, но с ней можно работать, если соблюдать все меры предосторожности.
Водород — бесцветный нетоксичный газ без запаха. Его растворимость в воде при 30 С составляет 16,3 мл газа/л (коэффициент Бунзена). Вследствие низкой плотности (м. в. 2,016 г/моль) газ обычно собирается поверх массы воздуха, кислорода, СО, и других газов или газовых смесей. Обычно для рутинной работы с водородными бактериями используют смесь 0,05 атм кислорода, 0,1 атм СОз и остальное (до 1 атм) — Нп 15.1.4.
Хранение и поддержание водородных бактерий Некоторые штаммы водородных бактерий сохраняют автотрофные свойства, несмотря на многочисленные пересевы на среды с органическими веществами (например, Рагасоссиз г)епйгЯсапгь выделетпгьгй М. Бсйеринком в 1910 г ). Другие виды, однако, легко теряют способность к водородной автотрофии при выращивании гетеротрофно, что может объясняться нестабильностью плазмид (Луг/гобеппрйа~а/)ага, /тосагг(га ориса). Поэтому водородные бактерии рекомендуется поддерживать в автотрофных условиях, где они также более стабильны по сравнению с гетеротрофными и остаются жизнеспособными до 6 и более месяцев при 4 'С. Выживаемость клеток на скошенном агаре может быть повышена при заливке его парафиновым маслом.
Водородные бактерии хорошо переносят лиофилизацию в 5 %-м глутамате, снятом молоке с 5%-м глутаматом, мело-инозитолом (5%) или медом (10%). Для процедуры лиофилизации берут автотрофно выросшие культуры клеток. 206 15.1.5. Определение гидрогеназной активности Ддя определения гидрогеназной активности в автотрофно выросших на чашках колониях используют методы, основанные на образовании нерастворимого в воде формазана красного цвета, появляющегося при восстановлении ТТХ гидрогеназой за счет водорода. Метод А выявляет наличие растворимых и мембраносвязанных гидрогеназ, тогда как метод Б — только мембраносвязанных гидрогеназ вследствие ингибирования активносги всех цитоплазматических гндрогеназ в присутствии моной од-ацетата.
Метод А. Помещают стерильный мембранный фильтр с диаметром пор 0,22— 0,45 мкм на чашку с минеральным агаром. Переносят штаммы, проверяемые на активность гидрогеназы, пприхами петлей, под номерами, на филья. Если колонии не имеют тенденции расплываться, то на олпом фильтре можно разместить до 10 точек разных колоний. Инкубируют фильтр на чашке в атмосфере: 5% Оз+ 10 % СО2+ 85% Нь Г1осле развития колоний помещакгг фильтр на смоченную 0,1 -м ТТХ фильтровальную бумагу (см.
метод выше). Иногда метод дает положительные результаты при инкубации в анаэробной атмосфере без Н„видимо, вследствие эндогенного дыхания за счет пула запасных органических веществ. Метод Б. Клетки выращивают аэробно на агаризованной минеральной среде с глюконатом (0,1% (ча-глюконата), с тем чтобы на чашке было от 80 до 100 колоний (48 ч).
Диск фильтровальной бумаги опускаю~ на поверхность чашки и слегка прижимают к ней, побы колонии дали отпечатки на диске. Диск помечают карандашом и совмещают с меткой на чашке. Обычно через 3 мин диск снимают и помещают в другую чашку Петри, стороной с отпечатками колоний вверх, на другой фильтр, пропитанный 0,4 мл 0,2 М ацстатом и 0,8 мл 4%-м ТТХ, растворенными в 0,067 М К-фосфатном буфере (рН 7,0). После 30 мин инкубации чашку помещают в прозрачный эксикатор, который заполняют )х(, для обнаружения зндогецного восстановления краски.
После 20 — '30 мин инкубирования при комнатной температуре атмосферу в эксикаторе замещают на Н,. Колонии, содержащие мембраносвяэанные гидрогеназы, окрашиваются при этом в пурпурно-красный цвет. Реакция обычно проходит за 30 мин. Метод В. Активность гидрогеназы можно определить в бесклеточных экстрактах клеток, выросших под водородом. Для этого клетки разрушают одним из способов, описанных в гл.
13, и получают их бесклеточные экстракты. Гидрогеназу определяют при 570 нм в кювете с ллиной оптического пуги 1 см. Добавление глюкозы, глюкозооксидазы и каталазы препятствует спонтанному окислению восстановленной метилеиовой сини. Реакционная словеса содержит; К-фосфатный буфер (50 мМ, рН 7,0) с 167 мкМ метиленовой сини — 2,5 мл; глюкозу (4 мМ) — 50 мкл; глюкозооксидазу (60 мг/мл) — 10 мкл; каталазу (20 мг/мл) — 10 мкл; экстракт — О,1 — 0,2 мл (1 — 2 мг) белка и воду дистиллированную — до 3,0 мл.
До добавления экстракта кюветы закрывают резиновыми пробками и продувают через две иглы чистым водородом. Коэффициент молярной экстинции для метиленовой сини — 13,1 сыз/мкмоль. При определении можно использовать целые клетки разбавленных суспензий бактерий. Метод Г. Этим методом определяют активности гидрогеназы (НАД'-зависимой) в бесклеточных экстрактах. Экстинцию измеряют при 365 нм с НАД' как акцептором электронов. Реакционная смесь (3 мл) содержит 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 8,0), 0,8 мМ НАД' и соответствующее количество экстракта клеток. До добавления экстракта кювету продувают водородом (см.
метод В). Коэффициент малярной экстинции НАДН вЂ” 6,22 см/ммоль. 207 15.2. КАРБОКСИДОБАКТЕРИИ К карбоксидобактериям Гтермин предложен Г.А. Заварзиным в 1972 г.) относят группу аэробных водородных бактерий, способных окислять СО. Все до настоящего времени выделенные карбоксидобактерии способны также литотрофно окислять водород„тогда как не все водородные бактерии могут использовать СО как источник углерода и энергии для роста. Карбоксидобактерии — факультативные автотрофы и обычно мезофилы. Однако есть сведения об умеренно термофильном стрептомицете Ягсрготусез Яегтоаию(гпрйкиз, который, помимо способности расти автотрофно и аэробно за счет окисления СО, обладает нечувствительной к кислороду нитрогеназой.
Кроме СО карбоксидобактерии способны использовагь для роста и некоторые многоуглеродные соединения: ацетат, малат, сукцинат, этанол, пропанол и др. Некоторые штаммы растут в присутствии одноуглеродных соединений — метанола и формиата. В зависимости от вида карбоксидобактерии требуют различного содержания СО в газовой фазе — от 20 до 95 об. %. Окисление СО проходит по уравнению СО -ь ~/зО, — ь СОп ЛО' = -283,0 кЪк/моль Для фиксации 1 моля СО, клетки должны окислить 7 молей СО по уравнению 7СО + 2~/гО~ + НтΠ— ь (НрО) + 6СОг Реакцию окисления СО проводит особая СО-дегидрогеназа, часто она бывает НАД'-зависимой: СО+ НзО+ А-+ СОз+ НзА, где А — окисленная форма акцептора электрона. В тех случаях, когда природный акцептор электрона СО-дегидрогеназы неизвестен, реакцию проводят в присутствии метиленовой сини.
Молекулярная масса большинства выделенных и очищенных СО-дегидрогеназ карбоксидобактерий — около 230 кДа. Бактерии, окисляющие СО, формируют дыхательную цепь, участвующую в переносе электронов от СО к кислороду, заканчивающуюся особой цитохромоксидазой, нечувствительной к СО. Известен рад микроорганизмов, среди которых хорошо изучены фототрофные пурпурные бактерии, растущие в темноте в анаэробных условиях со 100 % СО в качестве газовой фазы с образованием молекулярного водорода по уравнению СО + НзΠ— > СОг + Нз Некоторые метаногены (МсгЬалозагс1ла Ьагlгел') способны использовать СО, преобразуя его в метан: СО + 2НгΠ— + СНя + СОз Выделение кврбоксндвбактернй.
Карбоксндобакгсрни выделяют нз верхних слоев почвы вдоль оживленных городских магистралей, нз дерновых матов, которыми углежогн обкладывают поленницы дров прн чрвднцнонном способе производства древес- 208 ного (и активированного) угля, из почв областей с высокой вулканической активностью или с частыми лесными пожарами. Среды — обычно минеральные с добавлением или без добавления витаминов (в виде раствора смеси витаминов или дрожжевого автолизата). Газовая фаза герметических сосудов лля культивирования должна содержать смесь СО и воздуха в различных концентрациях (см. с.
206). Обычно культивирование проводят в качалочных колбах с резиновыми пробками, которые постоянно перемешивают на качалке лля лучшего газообмена. Примеры сред лля купьтивирования карбоксилобактсрий приведены в приложении 4. 15.3. БАКТЕРИИ, ОКИСЛЯЮЩИЕ МАРГАНЕЦ Марганецокисляющие микроорганизмы — филогенетически разнообразная группа, объединенная способностью окислять двухвалентный растворимый ион марганца (Мпм) до нерастворимых соединений общей формулы МпО, где х — некоторое число между 1 и 2, в которых марганец находится в четырехвалентном состоянии. Такое окисление в природе приводит к накоплению легко обнарухсиваемых нерастворимых осадков оксидов марганца (ТЧ) черного или коричневого цвета.
К окислению марганца способны многие микроорганизмы — бактерии, грибы, водоросли. Среди бактерий такая способность обнаружена у многих филогенетически различающихся групп микроорганизмов: цианобактерий, гетсротрофных палочек и кокков, образующих чехлы (подобно Т.ергойах) и почкующихся (подобно Яурйот!сгойит) бактерий, некоторых автотрофных штаммов, близких псевдомонадам, и среди представителей все еше загадочного рода Ме~а/(одетшл. Анаэробные лактобациллы не включены в их число, так как окисление Мп служит у них защитой от вредного действия кислорода, оксиды Мп не откладываются внеклеточно, а накапливаются до миллимолярного уровня в цитоплазме в связанном с белками виде.
Окисление Мпт' в Мп4' термодинамически выгодно в аэробных условиях (Л6' = -67,2 кДж/моль), однако высокая энергия активации процесса делает Мп" довольно стабильным элементом в водных средах. Энергетический барьер может быть преодолен повышением рН или добавлением Мп-связывающих компонентов, включая сами оксиды Мп, которые являются активными хелаторами для Мп~'. Поэтому катализ окисления Мпм оксидами Мп (аутоокисление) затрудняет точное разделение микробного и химического окисления, особенно в природных экосистемах, где органические хелаторы и частицы оксидов Мп присутствуют в большом количестве.
15.3.1. Распространение Мп-окислнющих микроорганизмов Окисляющие Мп ' микроорганизмы вездесущи, их можно выделить почти лз любой пробы почвы или воды. Особенно большие их количества связаны с глубоководными осадками оксидов Мп, выходами гидротерм, окислительновосстановительными переходами осадков фьордов, пленками осадков в пустынях, осадками Мп в водопроводных трубах, богатых Мп поверхностных биопленках неглубоких озер, осадками пресноводных озер и железомарганцевыми осцаками. Особенно Мп-окислитсли распространены в зонах переходов от окис- 209 ления к восстановлению. В анаэробных зонах Мп ' или Мпи могут быстро восстанавливаться за счет анаэробного Мп-дыхания от органических или нсорганических доноров электронов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
