А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 58
Текст из файла (страница 58)
У)очевина — продукт разложения органических соединений азота в организме животных и человека, посредством образования этого соединения животные выводят избыток аммиака через мочевую систему. Мочевина разлагается ферментом уреазой, образуемой многими представителями различных физиоло;ических групп микроорганизмов — как про- так и эукариотических. Фермент может быть вне- и внутриклеточным относится к классу гидролаз: СО(ННт)т+ НгО -э 2ННз+ СОз Уробактерии используют некоторые углеводы или органические кислоты в качестве источника углерода и энергии. Принципы постановки накопительных культур для выделения уробактерий — те же, что и для аммонификаторов с лакмусовым тестом па образование аммиака). Подробнее о постановке опыа см. в приложении 1. 14.3.
ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ вЂ” ПРОДУЦЕНТОВ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Пектиловые (межкиегочн ые) вещества (от греч. рес1уз — студень) представляют собой полисахариды, состоя~цие из остатков В-галактуроновой кислоты, оединенных а-1,4-гликозидными связями. Карбоксильные группы полигалакгуроновой кислоты могут быть полностью или частично этерифицированы метанолом.
Пектиновые вещества содержатся в любом растительном материале, но больше всего их в землянике, яблоках, грушах, крыжовнике, персиках, векле, луке, моркови. Пектиновые вещества подразделяются на несколько групп. Протопектин лредставляет собой нерастворимое в воде соединение сложного химического 197 строения.
Пектиновая кислота — полигалактуроновая кислота, в малой степени этерифицированная остатками метанола; пектин — почти полностью этерифицированная пектиновая кислота; пектовая кислота — полигактуроновая кислота; пектинаты — соли пектиновой кислоты; пектаты — соли пектовой кислоты. В присутствии сахара, кислоты и под действием поливалентных ионов металлов пектины образуют гель. Пектиновые вещества являются субстратами для ряда пектолитических (пектинолитических) ферментов — пектинлиазы (КФ. 4.2.2.10), экзополигалактуронатлиазы (КФ.
4.2.2.9), полигалактуроназы (полигалактуронидгликаногидролаза, КФ. 3.2.1.15), пектинэстеразы (пектингидролаза, КФ. 3.!.1.11). Пектинлиаза деполимеризует пектин путем элиминирования остатков 6-метил-о- 4,5-Р-галактуроната. Экзополигалактуронатлиаза элиминирует Л-4,5-Р-ппактуронозо-Р-галактуронатные остатки с редуцирующего конца деэтерифицированного пектина. Полигалактуроназа осугцествляет гидролитическое расщепление а-1,4-гликозидных связей в цепи пектиновых веществ. Пектинэстераза атакует этерифицированные карбоксильные группы. Пектолитические ферменты образуют комплексы, отдельные компоненты которых расщепляют молекулу пектина в различных местах. Комплекс ферментов, синтезируемый микроорганизмами, различен и зависит от вида продуцента, состава среды и условий культивирования.
Значительное число микроорганизмов образуют ферменты, разлагающие пектины. Они широко распространены у грибов и бактерий. Бактерии рода С!оз!г!г(шт, например С!. рес!тоХегл~елгат, С!. Ьигуг!сит, продуцируют комплекс пектолитических ферментов и получают энергию, осуществляя маслянокислое брожение пектиновых веществ. Химиям брожения пектиновых веществ состоит из двух последовательных стадий.
В первой стадии они гидролизуются до сахаров, во второй идет сбраживание отдельных продуктов гидролиза — галактозы и арабинозы до масляной кислоты, СОт и Нз Бактерии рода С!озгг!йище играют важную роль в процессе мацерации волокон при мочке льна. Несколько пектинолитических фермеьпов обнаружены у Вас!!!из ро!)аяуха. Фито- патогенные виды бактерий рода Егтг!л!а вызывают распад тканей ряда растений также благодаря высокой активности комплекса пектолитических ферментов.
Грибные пектолитические ферменты наиболее стабильны и имеют оптимум рН от 3,5 до 5,0. Некоторые фитапатогенные грибы, например Рпзагтигл охузрогпщ, обладают высокоактивным пектолитическим комплексом ферментов, обусловливающим их патогенность. В промышленных условиях пектолитические ферменты получают в основном из Азрегя!!(из аиатог1, А, и!Хег и других видов грибов при поверхностном и глубинном способах культивирования. Для выделения культуры бактерий, образующих пектолитические ферменты, из гниющей моркови, используют пектиновый агар состава: полипектат натрия — 18,0 г/л: кристалл виолет (0,075%-й водный раствор) — 2,0 мл г/л; )ча)ЧОз — 2,0 г/л; СаС!з 2НзО (10%-й водный раствор) — 14 мл; цитрат натрия — 5,0 г/л; тр питон — 1,0 г/л; новобиоцин (1%-й водный раствор натриевой соли) — 4 мл; агар — 4,0 г/л; вода водопроводная — до 1 л.
Значение рН среды до стерилизации доводят до 7,0. Стерилизацию проводят 30 мин при 0,5 ати. Новобиоцин (рН 7,0) стерилизуюг фильтрованием и добавляют в среду после ее автоклавирования. Полипектат натрия включают в состав среды в качестве основного источника углерода. При выращивании микроорганизмов на твердой среде пектолитиче- 198 ские ферменты диффундируют в агаровый гель вокруг колонии. Колонии бактерий, образующих пектолитические ферменты, можно обнаружить по глубоким впадинам или ямкам, которые образуются за счет фермснтативного расщепления пекгинового геля и по характерной каплевидной морфологии колоний. Цитрат натрия добавляют в среду, чтобы уменьшить развитие бактерий рода Рзедг(стопах в пользу преимущественного роста бактерий рода Егвииа. Антибиотик новобиоцин подавляет рост многих грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий.
Кристаллвиодет также подавляет развитие грамположительных почвенных бактерий, в основном принадлежащих к роду ВасИ(!!к Для опытов используют подверженную начальному этапу процесса гниения морковь. Питательную среду, предназначенную для работы по выделению чистой культуры, расплаштяют и разливают в стерильныс чашки Петри из расчета 6 чгннек (около 120 мл) на один объект и подсушивают при 30 — 35 С в течение 24 — 48 ч. Выделение продуцевта пектолвтических ферментов. Перед выделением культуры микроорганизма из моркови обьект осторожно моют водой с мылом, осторожно протирают ватой, смоченной 70%-м этиловым спиртом, и помешают в стерильный стеклянный сосуд. Стерильной иглой или скальпелем делают в кожице моркови в месзе гнилостного поражения отверстие диаметром 3 — 4 мм.
Из этого отверстия стерильно, с помощью бактериологической петли, берут небольшой комочек гниющей ткани и переносят в пробирку с 6 — 7 мл стерильной волопроводной воды. Содержимое пробирки энергично перемешивают встряхиванием. Выделение культуры возбудителя процесса гниения проводят с помощью бактериологической петли методом истощающего штриха. Используют 3 чашки Петри с соозветствующей сгерильной средой. Кроме этого, для получения чистой культуры используют стеклянные шпателя Дригальского. С этой целью петлю (чзеркальцсь) суспензин гнилостных микроорганизмов наносят на поверхность стерильной среды в чашке Петри, а затем распределяют микроорганизмы стерильным шпателем и, не обжигая шпатель в пламени горелки, распределяют материал по 2-й и 3-й чашкам Петри со стерильной средой.
Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22 'С в течсние 3 дней. Выросшие колонии обнаруживают по глубоким впадинам или ямкам. Бактерии рода Его!лга образуют характерные каплевидные полупрозрачные колонии. Проводят изучение морфолосии клеток бактерий, образующих пектолитические ферменты, используя окрашенный фуксином препарат (объектив !00к). Определение активности вективэстеразы.
Для определения активности псктинэстеразы получают биомассу бактерий. Для этого с помощью бактериологической петли производят поссв бактерий из полученных характерных колоний бактерий рода Еги ииа на поверхность псктннового агара в 3 чашках Негра частыми штрихами. Засеянные чашки инкубируют в термостате при 22 С в течение 2 сут. Биомассу с чашек смывают стерильным физиологическим раствором, рН 7,0. Разрушение клеток проводят на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН при 22 кГц в течение 6 циклов по 30 с с перерывами по ! мин при охлахогении.
Полученный гомогенат центрифугируют 20 мин при 40 тыс. я. Супсрнатант используют для определения активности пектинэстеразы. Псктинэстераза представляет собой гидролазу эфиров карбоновых кислот, Ионы и ц Са и Мя акгивируют фермент. Пектинэстсраза омыляет сложные эфирные связи в пектиновой кислоте и пектнне и отщепляет метиловый спирт.
Отщепление СНз-групп происходит последовательно, начиная со свободной СООН-группы. В результате действия фермента в реакционной среде накапливаются частично нли полностью деметоксилированная полнгалактуроновая кислота и метиловый спирт. В 3 мл реакционной смеси солержится: калий-фосфатный буфер (0,1 М, рН 6,5) — 2,0 мл; полипекгат натрия — 0,05 г; СаС1з — 4 мМ; МяС1~ 6НзΠ— 5 мМ; экстракт бактерий — О,! мл„ дистиллированная вода — до 3 мл.
Время опыта — 20, 40, 60 мин при 30 С. В конт- 199 рольную пробу вместо экстракта добавляют воду. Реакдию останавливают 0,3 мл 50%- й ТХУ. Активность фермента определяют по количеству образовавшегося метанола. Метанол определяют на газовом хроматографе (см. гл. 23). 14.4. АКТИНОМИЦЕТЫ [КЛАСС АСТ1МОВАСТЕИА) Актиномицеты — это чрезвычайно разнообразная группа грамположительных бактерий, включающая в настоящее время более 60 родов. Среди представителей актиномицетов есть организмы, обладающие самой разной морфологией — это кокки, плейоморфные палочки„палочковидные организмы, которые на определенном этапе своего развития образуют нитевидные формы, и, наконец, истинные мицелиальные актиномицеты, образующие как субстратный, или вегетативный, так и воздушный мицелий.
Размножаются эти бактерии бинарным делением, фрагментацией нитевидного мицелия или путем образования спор. Актипомицеты характеризуются высоким содержанием гуанина и цитозина в молекуле ДНК: 58 — 77 мол. уе. Все они являются хемоорганотрофными микроорганизмами, и большая их часть принадлежит к строгим аэробам. Однако среди представителей этой группы бактерий встречаются также анаэробныс и факультативно-анаэробные формы. Экологическая ниша болыпинства актиномицетов — это хорошо аэрируемая зона почвы, где они ведут сапротрофньтй образ жизни.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
