А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 57
Текст из файла (страница 57)
выше); раствор пероксилазы хрена (10 МЕ) — 10; глюкоза (10 мкмолей) — 10; раствор фермента (0,5 — 1 мг белка) — 10. Реакцию начинаю.г добавлением фермента (ГО) и регистрируют изменение поглощения раствора при 436 нм в течение 1 — 2 мин. За единицу активности ГО принимают количество фермента, которое окисляет ! мкмоль глюкозы в 1 мин при рН 7,0 и 20 С. 13.2.10.
Глутаматоксидаза Глутаматоксидаза (ГлутО, НФ 1.4.3.11) — растворимый внеклеточный фермент, образуемый некоторыми стрептомицетами. Определение основано на 193 НстяусОВ количественном учете изменения концентрации перекиси водорода, образу- ющейся в реакции окисления глугаминовой кислоты ГлутО: 1;глутаминовая кислота + Оз+ НзΠ— ь а-кетоглутаровая кислота + + 74Нз+ Н70з Реихяиояяая смесь содержит в 1 мл (мкл): КРО4-буфер с о-дианизидином (рН 7,0. 50 мМ) — 970 (приготовление см.
выше); раствор пероксидазы хрена (1О МЕ) — 1О: Ь-глугамат (10 мкмолей) — 10; раствор фермента (0,5 — 1 мг белка) — !0. Реакцию начинают добавлением фермента (ГлутО) и регистрируют изменение поглощения раствора при 436 нм в течение ! — 2 мин. За единицу активности ГлутО принимают количество фермента, которое окисляет 1 мкмоль глугамата в 1 мин при рН 7,0 и температуре 20 С.
13.2.11. Оксидаза Оксидаза — конечный переносчик электронов от восстановительных эквивалентов по дыхательной пепи, передающий их непосредственно на кислород с последующим его восстановлением до воды. Терминальная оксидаза присуща всем аэробным микроорганизмам и даже некоторым анаэробным, в частности сульфатредукторам. Бактерии и архон зачастую имеют разветвленные дыхательные цепи с двумя или более оксидазами. На основании природы донора электронов — цитохром с или хинол — различают соответственно цито- хром- или хинолоксидазы. Оптимумы рН и температуры ферментов существеннс варьируют в зависимости от объекта. Опрелеление.
Оксидазную активность определяют полярографически. Реакционная смесь для измерения цитохромоксидазной активности содержит соответствующий буфер; исследуемый материал (грубый экстракт или мембранную фракцию); 2 мМ аскорбат и 0,2 мМ 7у,)у,!Ч,Юстетраметил-л-фенилендиамин (ТМФД). В случае измерения хинолоксидазной активности вместо аскорбата/ТМФД в качестве субстрата используют восстановленные 5 мМ ДТТ хинолы или их аналоги (дурохинол). Оксидазную активность выражают в наномолях потребленного кислорода в 1 мин на 1 мг белка. Цитохромоксидазную актнвность можно измерить также спектрофотометрическа по скорости образования окисленной формы ТМФД (синий Вурстера). В спектрофотометрическую кювету вносят соответствующий буфер, 0,2 мМ ТМФД и измеряют увеличение оптической плотности при 560 нм в результате окисления субстрата кислородом воздуха, затем добавляют раствор фермента и продолжают измерение. Оксидазнук активность определяют по разнице между двумя скоростями окисления (опытной с контрольной)„учитывая, по коэффициент молярной экстинкпии ТМФД при 560 нх: составляет 12,1 мМ ' см '.
За единицу оксидазной активности принимают ~акое количество фермен.га, которое окисляет 1 мкмоль ТМФД в 1 мин при соотвстствуюшнх условиях реакции. 13.2.12. Пероксидаза Пероксидаза (НФ !.11.1.7) катализирует окисление полифенолов в присутствии органических перекисей или перекиси водорода. Образуя с перекиськ комплексное соединение, она активирует кислород перекиси и с его участнсх окисляет субстрат: НзОз + ДНз -+ 2НзО + Д 194 С кислородом воздуха пероксидаза не реагирует. В составе каталитического центра фермент содержит железо, обладает сравнительно высокой термостабильностью и ограниченной специфичностью: способен действовать на пирогаллол, гилрохинон, пирокатехин, ортокрезол и некоторые другие фенолы и ароматические амины.
Оптимум рН пероксидазы находится в нейтральной или слабошелочной области н несколько колеблется в зависимости от субстрата. Оптимальная температура для активности около 20 'С. Определение. Пероксилазную активносп измеряют колориметрическим методом по скорости развития окраски в индикаторной реакции разложения НзОз ферментом. Освобожденный в пероксилазной реакции кислород окисляет индикатор (например, о-лианизидин), переводя его в окрашенное соединение Д: НзОз ч ДНз -в 2НзО + Д.
В спектрофотометрическую кювету вносят 840 мкл 0,5 М К-фосфа пюго буфера (рН 7,0); 10 мкл 3%-й НзО,; 100 мкл хромогена 15 мг е-дианизидингидрохлорнла/мл) и измеряют поглощение при 436 нм. Затем добавляют 50 мкл раствора фермента и фиксируют увеличение оптической плотности за счет развития желто-оранжевой окраски. Контролем служит проба, содержащая прокипяченный раствор фермента. Пероксилазную активность определяют по разнице между двумя скоростями окисления (опытной и контрольной), учитывая, по коэффициент молярной экстинкции окисленной формы о-дианизидина при 436 нм составляет 8,3 мМ ' см-'. За единицу пероксидазной активности принимают такое количество фермента, которое окисляет 1 мкмоль е-дианизидина в ! мин при рН 7,0 и температуре 25 С.
13.2.13. Каталаза Каталаза (НФ 1.11.1.6) катализирует разложение перекиси водорода на воду и кислород: 2НзОз — э 2НзО + Оз Каталаза широко распространена в природе; она содержится как у аэробных, так и у анаэробных микроорганизмов. У большинства микроорганизмов каталаза обладает широкими оптимумами рН (4,5 — 9,0) и температуры (15— 40 'С).
Однако каталазную активность принято измерять при нейтральном значении рН и комнатной температуре. Определение. Каталазную активность определяют спектрофотометрически по скорости разложения перекиси водорода Ферментом. В спектрофотометрическую кювету вносят 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,0)„50 мМ Н,О, и измеряют поглощение при 240 нм.
Затем добавляют раствор фермента и фиксируют уменьшение оптической плотности в результате разложения НзОз (еив = 43,6 М нем ~), За единицу каталазной активности принимают такое количество фермента, которое разлагает 1 мкмоль Н,Оз за 1 мин при рН 7,0 и температуре 25 'С. РАЗДЕЛ Ш ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ОТДЕЛЬНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП Глава 14 АЭРОБНЫЕ ОРГАНОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ Микроорганизмы редко развиваются в виде чистых культур в природных популяциях, однако свойства отдельных видов изучают на чистых кулшурах.
Поэтому необходимо выделять чистые культуры из природных сообществ, где различные микробы сосуществуют в одном и том же микроокружении. Постановка накопительных культур позволяет преимущественно увеличить численность желаемой физиологической группы микроорганизмов перед выделением чистых культур (подробнее см. гл. 6). Аэробные хемоорганогетеротрофы в природе ответственны за основную массу минсрализуемого отмершего органического вещества (например, листового спада). Они перерабатывают также белки, жиры, полисахарилы, нуклеиновые кислоты и другие мономеры и полимеры мортмассы.
В данной главе рассмотрены некоторые примеры и приемы„позволяющие выделить аэробных органотрофов из природных сообществ. Другие примеры выделения приведены в тексте задач малого практикума по микробиологиии для студентов-биологов (см. приложение !). 14.1. АММОНИФИЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ Аммови4акация — это процесс аэробного или анаэробного превращения органического азота в аммиачную форму. Его осуществляют микроорганизмь: различных физиологических и таксономических групп, включая бактерии, актиномицеты и грибы.
Процесс аммонификации происходит с помощью внеклеточных протеаз различной природы, которые могут гидролизовать белки г широком лиапазоне рН вЂ” от кислых значений до щелочных. Аминокислоты. получающиеся в результате такого гидролиза, поступают в клетку в результате диффузии или с помощью специфических транспортных процессов, где дезяминируются с выделением аммиака обычно в газообразной форме.
Клетки используют органические кислоты в качестве источника углерода и энерпп:.. часть образованного аммиака может усваиваться также в анаболических прсцессах, однако большая его часть выделяется в свободном виде. Аммонификацию в средние века использовали в процессе получения селитры, компонен-= дымного пороха, после окисления аммиака в аэробном процессе нитрифик:- 196 торами первой и второй фазы.
При аммонификации белков выделяются также сероводород, меркаптаны, индол и скатол — все они имеют резко неприятный запах гниющих яиц. Аммиак, выделяклцийся при аммонификации, посту- лает в глобальный цикл азота, где может быть окислен нитрификаторами, ассимилирован в белки или усвоен растениями в виде нитратов (с последуюшей ассимиляционной нитратредукцией). В последнее время аммонификацией называют также процесс, который приводит к восстановлению нитратов до аммиака с получением при этом метаболитической энергии. Для изучения процесса аммонификации подходят простые среды (МПБ с 3 % пептона), которые засевают пробами любой почвы.
Для обнаружения вызеляюшегося аммиака между стенками колбы и ватной пробкой закрепляют красную лакмусовую бумажку (проба на аммиак) и фильтровальную полоску зумаги, смоченную раствором уксуснокислого свинца (проба на сероводород и меркапганы). Опытные колбы обычно инкубируют при 28 — 30 'С и анализируют на 3 — 5-е сугки. Подробнее о постановке опыта см. в приложении 1. 14.2. УРОБАКТЕРИИ Уробактерии являются распространенными представителями микробиоты, яспользуюшими органический азот и, в частности, разлагаюшими мочевину.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
