А.И. Нетрусов, М.А. Егоров - Практикум по микробиологии (1125598), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Проведение определения. Из культуральной жидкости полисахариды вьщеляют осаждением 3 — 5 объемами этанола или изопропанола; осадок, образующийся за 24 ч при комнатной температуре, отделяют центрифугированием (3 тыс. я, 15 мин) и сушат па воздухе. Для определения моносахаридного состава проводят гидролиз ! — 2%-го препарата полисахарила в 1 и.
НС! при 100'С в течение 3 ч в герметическом сосуде и затем смесь доводят сухим бикарбонатом натрия до нейтральной реакции по индикатору. Раствор гидролизованного полисахарида хранят а холодильнике. Количество редуцирующих сахаров в гидролизате полисахарида определяют по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), используя в качестве стандарта раствор О-глюкозы. Качественный моносахарилный состав полисахарида определяют метолом хроматографии на бумаге с соответствующими свидетелями. Для определения образования внутриклеточных полисахаридов в качестве запасных веществ проводят кислотный гидролиз клеточной массы и в гидролизате определяют количество редуцирующих сахаров.
12.7. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК МИКРООРГАНИЗМОВ Главный полимер клеточной стенки болыпинства бактерий — пептидогликан (ПГ). В современной классификации грамположительных бактерий лля характеристики рода и вида учитывают его строение. Известно около 100 типов ПГ. Все грамотрицательные бактерии содержат, за неболыпим исключением, один тип ПГ. У этих бактерий его строение нс является таксономическим признаком.
178 Выделение и очистка фракций клеточных стенок. Фракции ю>сточных стенок для анализа ПГ получают после механического разрушения клеток бактерий (ультразвуковой дезинтегратор с бусами илн без; декомпрессионный шок, см. выше) и центрифугирования при !5 тыс. 8 в течение 20 мин (условия осаждения могут несколько различаться в зависимосги от вида). Полученный осадок делится на два слоя: пижний— неразрушенные клетки, и верхний, студенистой консистенции, — клеточные стенки. Верхний слой осадка отделяют и несколько раз промывают водой, пока расслаивание осадка не прекратится (нижний слой каждый раз отбрасывак>т). После последнего промывания (всего 5 — б промываний) верхний слой отмытых клеточных стенок лиофияизиру>от или высушивают при обработке спиртом (3 раза), эфиром (2 раза), затем на воздухе или в вакуум-эксикаторс.
Высушенную массу стенок грам положительных бактерий экстрагируют триююруксусной кислотой (ТХУ) для удаления тейхоевых кислот. С этой целью к 100 — 200 мг сухих клеточных сгепок добавляют 1Π— 20 мл 5%-и ТХУ и суспензию нагревают при 100 С в течение 20 мин. Сл>есь охлаждак>т и осадок стенок отмывают водой при центрифугировании до кислотности, близкой к нейтральной. Осадок суспендируюг в 50 мМ >прис-НС1-буфере (рП 7,8), препарат обрабатывают трипсином (2,5 мг сухого фермента в 2,5 мл буфера на каждые 10 мг стенок) в течение 20 мин при 37 С при постоянном перемешивании. Осадки стенок промывшот 3 раза буфером и обрабатывают 2%-м дезоксихолатом натрия в том же буфере для удаления белков.
Обработку ведут 5 миц при 100 С. Затем детергент отмывают сначала 3 раза !и. )чаС1, а после 3 — 5 раз дистиллированной водой. Полученный препарат ПГ высушивают при обработке спиртом (3 раза), эфиром (2 раза) и досушивают в вакуум-эксикаторе. Анализ состава пептидогликана. Выделенный и очищенный препарат ПГ гидролизуют в 4 н. НС!. Для этого 2 — 3 мг ПГ помешакп в ампулу, добавляют 0,5 мл кислоты и запаянную ампулу ннкубируют в течение 1б ч при ! 00 С. В редких случаях бывает необходим гидролиз препарата 6 и. НС! в течение 18 ч при 100 С или 3 и. трифторуксусной кислотой в течение 4 ч при 100'С. После проведения гидролиза и охлаждения ампулы ее вскрывают и гидролизат переносят на чашечку из фторопласта.
Из гидролизата НС1 удаляют в вакуум-эксикаторе, многократно добавляя в чашечку по 0„5 мл дистиллированной воды и высушивая в эксикаторе. В дальнешпем гидролизат количественно переносят в мернук> пробирку, объем доводят бидистиллированной водой до 1 мл и при необходимости центрифугируют. Анализ гидролизата проводят на аминокислотном анализаторе, после чего вычисляют мольное отношение аминокислот, мурамовой кислоты и глюкозамина. В том случае, когда в гилролизате обнаруже>га диаминопимелиновая кислота, определяют ее стереоизомер.
Для определения стереоизомера диаминопимелиновой кислоты (ДАР!) гидролизат ПГ (нз расчета 1 мг исходного ПГ; при отсутствии белка в клеточной стенке можно использовать ее гидролизат) разделяют хроматографией иа бумаге в системс растворителей: метанол — вода — ПС1 — пиридин (объемное соотношение 40: 13: 2: 5). Хромато>рамму высушивают, опрыскивают 0,5%-м нинпщрином и нагревают в течение 5 мин при 100 — !10'С. ДАП проявляется в виде желтых пятен на белом фоне. Полученные пятна сравнивают по Лг со стандартными образцами ь>ез»- и Е-формами ДЛП, кото рые должны быть нанесены на ту же хроматограмму в качестве свидетелей.
В некоторых случаях для таксопомических > >елей необходимо определить только природу диаминокислоты. ДАП определяют вышеописанным способом, лизин — хроматографически в системе бутанол — уксусная кислота — вода (4: 1: 1) и сравнивают со ста>щартом. Идентификацию редких диаминокислот проводят несколькими способами: хроматографически в разных системах растворителей или на амипокислотном анализаторе с соответствуюшил>и свидетелями. В гидролизате определяют амипосахарный >и аминокислотный состав ПГ. В большинстве случаев для целей таксономии достаточно определить мольное отношение аминосахаров и аминокислот.
В П1 может быть от 3 до б различных аминокислот, 179 однако в их составе никогда не встречаются разветвленные и ароматические аминокислоты. Предположим, что в пробе гндрол азата ПГ получено следующее количество аминосахаров и аминокислот (мкмоль): мурамовая кислота (М) — 4,03; глюкозамин (ГП)— 4,52; лиаминопимелиновая кислота (ДАП) — 5,03; аланин (А) — 9,81; глугаминовая кислота (ГК) — 5,40 (М вЂ” ГН вЂ” ДАП вЂ” А — ГК вЂ” 0,80: 0,90: 1,00: 1,95: 1,02).
Учитывая, что мурамовая кислота и глюкозамин при кислотном гидролизе частично подвергаются разрушсникь истинное мольное отношение в природном полимере данного типа составляет, по-видимому, 1: 1: 1: 2: 1. Выяснив, что ДАП имеет мезо-форму, приходим к выводу, что ПГ имеет А1у-тип, т.е. все остатки мурамовой кислоты замешены тетрапептндом, состоящим из двух остатков аланина, ДАП, глутаминовой кислоты, и перекрест между соседними пептидными единицами осуществляется напрямую (без аминокислот в мостике) между ДАП одной цепи и последним аланипом другой. Глава 13 ПОДГОТОВКА КЛЕТОК ДЛЯ ЭНЗИМАТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 13.1. ОБРАБОТКА КЛЕТОК И МЕТОДЫ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ Цель энзимологических исследований заключается в установлении путей получения клеткой энергии и синтеза основных метаболитов для построения новой клетки. Лучше всего проводить эксперименты на целых клетках, которые метаболически и структурно интактны, и во многих случаях такие оптимальные условия могут бьггь достигнуты.
Однако в большинстве случаев это сделать трудно, и исследователям приходится работать с менее идеальным материалом. В каждом отдельном случае необходимо выбрать, какой тип клеточного препарата более подхолит для проведения нужного эксперимента: растущие или покоящиеся целые клетки микроорганизмов, разрушенные препараты клеток или клетки с нарушенной клеточной стенкой или мембраной (методы лизиса и дезинтеграции описаны ниже). Интактные клетки Растущие клетки. В активно растущих бактериях идут все основные жизненные процессы, характерные для высокоорганизованных и отрегулированных систем, включая репликацию, и поэтому они являются наилучшим материалом для энзиматического анализа.
Где возможно, рекомендуется использование таких интактных растущих клеток. Покоящиеся клетки. Рост может быть остановлен удалением клеток (центрифугированием или фильтрованием) из среды культивирования с последующим суспендировапием их в нейтральной осмотически приемлемой среде, например в буферном физиологическом растворе илц в минеральной среде без источников углерода и азота. Обработанные таким образом клетки называют покоящимися. Они содержат весь набор ферментов, необходимых для роста, однако ферменты находятся в относительно 180 неактивном или покоящемся состоянии.
В таких клетках обычно наблюдают за одной реакцией или группой реакций, представляющих интерес. Можно проследить, например, поток электронов от субстратов, например Р-лактача или сухцината, через дыхательную систему в условиях, когда затраты на рост минимальны. Покоящиеся клетки можно использовать при изучении синтеза белка, транспортных систем лля переноса субстратов или ионов. Для этих экспериментов клетки обычно суспендируют в осмотнчески пригодной среде, содержащей 50 — 100 мкг/мл хлорамфенпкола, препятствующего синтезу белков. В некоторых случаях, например в опьпах по исследованию транспорта веществ в клетку, нужно быть уверенным, что покоящиеся клетки снабжены цсточником энергии.
Голодающие покоящиеся клетки. Для некоторых экспериментов важно, чтобы клетки были освобождены от эндогенных запасов энергии. Примером использования голодающих покоящихся клеток является эксперимент по измерению пула внучрнклеточного АТФ, образующегося за счет мембранного потенциала. Эндогенный уровень образования АТФ в неголодающих клетках затрудняет измерение АТФ, синтезируемого за счет хемиосмотнческого градиента.
Для Е. сон разработана процедура истощения энергетических запасов в циклической реакции фосфорилирования/дефосфорилировання и-мсп~лглюкозида, который в этих клетках фосфорилируется в результате действия фосфоенолпируват-фототрансферазной системы. Клетки осаждают центрифугированием при 4'С и отмывают О,! 2 М иуис-НС!-буфером (рН 8,0). Затем клеткя суспендируют до плотности 5 мг/мл в том же буфере, содержащем 20 мМ и-метилглюкочида и 40 мМ )ЧаХ», и инкубируют при 37 С от 45 до 120 мин в зависимости от вида оактерий.
Затем клетки отмывают от ингнбитора и используют в дальнейших эксперицентах. В болыпинстве случаев для уменьшения эндогенного метаболизма аэробных или факультативно-аэробных бактерий проводят интенсивную аэрацию плотной бактериальной суспензии я течение 2 — 4 ч в минеральной среде без источника углерода илн оуфере. Уменьшение клеточных резервов можно контролировать по снижению эндогенного дыхания полярографичсски, сравнивая его с уровнем дыхания в присутствии энергетического субстрата, например сукцината. 13.1.1. Лизис клеток Ливис клеток с применением ферментов. Разрушение (лизнс) клеточных стенок с применением дстергснтов н ферментов проводят обычно с небольшими порцнямн биомассы, причем этн методы дают более стандартную обработку зля каждой клетки в суспензия, так как концентрации детергснтов н ферментов практически одинаковы в любой порции пробы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
